Symbiotische Aussaat

[winwen]

Ja, das kann (muss) ich zu meiner Schande bestätigen. Mittlerweile bin auch ich soweit aus eigener Erfahrung sagen zu können, dass sauberes Arbeiten bei der symbiotischen Aussaat -ebenso wie bei der asymbiotischen- die Ergebnisse wesentlich nachvollziehbarer macht.
Wenn der Symbiosepilz einen Entwicklungsvorsprung hat, so hilft das zwar und es siehtz auch so aus als hätte eine Fremdinfektion Schwierigkeiten sich richtig breit zu machen, aber der Einfluss auf das Keimungs/Wachstums-verhalten ist wirklich deutlich.

Ich gehe davon aus, dass ich in Zukunft wieder zur Samenwäsche mit Chlorbleichlauge zurückkehren werde, mit 2-maligem Nachspülen mit autoklaviertem destilliertem Wasser und anschließendem Ausbringen der feuchten Samen auf Haferagar.

[Claus]

Ich gehe davon aus, dass ich in Zukunft wieder zur Samenwäsche mit Chlorbleichlauge zurückkehren werde, mit 2-maligem Nachspülen mit autoklaviertem destilliertem Wasser und anschließendem Ausbringen der feuchten Samen auf Haferagar.

Bisher gehe ich davon aus, dass es egal ist, ob mit Hypochlorit oder H2O2 desinfiziert wird. Hypochlorit wird für die meisten Erdorchideenarten nur bei der asymbiotischen Aussaat benötigt, weil da die Keimhemmung beseitigt werden muss. Bei der symbiotischen Aussaat besorgt das der Pilz.

Aber sicher bin ich mir da nicht, es ist durchaus möglich, dass Hypochlorit bei manchen Arten zu stark ist und die symbiotische Keimung verhindert. Also müsste man parallel arbeiten, das kostet viel Zeit.

[winwen]

Ich fürchte dass manche Samen derart versifft sind, dass 3%iges H2O2 gar nicht reicht-schon gar nicht ohne Spülmittelzusatz!
6 Minuten 0,7%iges NaOCl ist da gründlicher. Wie gesagt: Wenn es funktioniert (sprich: nicht die symbiotische Keimung verhindert) denke ich, ist das die sicherere Variante unerwünschtes biologisches Material loszuwerden als H2O2.

[Berthold]

Ich fürchte dass manche Samen derart versifft sind, dass 3%iges H2O2 gar nicht reicht-schon gar nicht ohne Spülmittelzusatz!

ja, das hängt stark von der Sauberkeit der Samen ab und die ist sehr unterschiedlich. Vor 2 Jahren hatte ich Orchis elegans ohne Desinfizierung ausgesät und hatte sehr gute Erfolge ohne Verschmutzung. Deshalb war ich der Meinung, eine Desinfizierung ist überhaupt nicht nötig aber da hatte ich mich gewaltig geirrt, ich hatte nur grosses Glück.

Trotz Desinfizierung in einer älteren H2O2-Lösung habe ich mir neulich eine gewaltige Infektion eingefangen. Da reichte wohl einfach die Wirkung nicht aus.

[Berthold]

Als eines der grössten Probleme der symbiotischen Aussaat stellt sich für mich inzwischen die Verunreinigung der Pilzkulturen über längere Zeit heraus.

Ich impfe im Augenblick B1-Gläser nicht mehr zum Zwecke der Aussaat, sondern nur noch, um die Reinheit der Pilzkultur zu beobachten.

Die Gläser der Mutterkulturen stehn bei mir über längere Zeit im Kühlschrank oder auf der Fensterbank herum. Dabei setzen sich aussen am Glas und insbesondere aussen an der Dichtstelle am Decken Sporen fremder Pilze und Bakterien ab, die beim Öffnen des Glases zur Probenentnahme auf den Pilzagar im Glas wehen. Im Mutterglas machen sie sich nicht bemerkbar, da sie von der Mutterkultur in Schach gehalten werden.
Entnimmt man nun aber ein Gelstück zur weiteren Impfung kann man Gelstücke erwischen, die ganz sauber oder auch mit Fremdsporen gemischt sind. Deshalb entwickelt sich die Kultur in den neuen frischen Gläsern manchmal normal aber manchmal eben auch als Mischkultur. Man trifft somit auf völlig undefinierte Verhältnisse und unvorhersehbare Entwicklung der Kultur.

Eine Fremdinfizierung des sauberen B1-Pilzes wird also durchaus nicht nur durch schlecht desinfizierten Samen bei der Ausbringung verursacht, leider.

[winwen]

...was uns auch bei asymbiotischer Aussaat zum offenbar kategorischen Imperativ der generativen Orchideenvermehrung führt: oberste Maxime ist Sauberkeit in jeder Hinsicht!

[Claus]

Es ist offenbar notwendig, sich eine saubere Rückstellprobe in den Kühlschrank zu stellen und die vor dem Öffnen zunächst von außen zu desinfizieren.

Ich habe von Frank ein Reagenzglas aus 2005, das war bisher als Erneuerungsquelle immer brauchbar. Allerdings sind Reagenzgläser auch nicht so gut zur Aufbewahrung geeignet. Ich grüble noch über eine bessere Methode nach.

[Berthold]

Es ist offenbar notwendig, sich eine saubere Rückstellprobe in den Kühlschrank zu stellen und die vor dem Öffnen zunächst von außen zu desinfizieren.

Claus, aber wie kommt man beim Desinfizieren von aussen tief genug in die Ritze zwischen Glas und Deckel?
Ich werde meine Gläser jetzt nach dem Impfen sofort von aussen stark mit Mikrozid einsprühen und in Plastigbeutel einknoten. Die sind zwar nicht 100%tig dicht aber die Wahrscheinlichkeit einer Versiffung der Dichtstelle von aussen sollte deutlich sinken. Dann kann ich die Gläser öffnen, ohne dass mir gleich etwas hinein weht.

Die Gläser sind ja noch zusätzlich mit einer Klarsichtfolie (von innen auch besprüht) mit Gummiring verschlossen. Dann müssen die Sporen durch 2 Engpässe, um an die Dichtstellen zu gelangen.

[Claus]

Claus, aber wie kommt man beim Desinfizieren von aussen tief genug in die Ritze zwischen Glas und Deckel?

Also bei Rundgläsern mit Schraubdeckel mache ich es beim Umlegen von asymbiotischen Aussaaten so: Ich fülle 0,5%ige NaOCl-lösung in einen Blumenübertopf passender Größe. Dann klebe ich auf den Deckel mit dem Loch und dem Wattestäbchen ein Stück Paketklebeband, damit diese Stelle dicht ist. Das Glas wird dann in der Lösung mit Hilfe eines Teelöffels mehrfach untergetaucht und dabei gekippt, damit die Lösung auch in den Spalt zwischen Glas und Deckel gelangt.

Danach wird das Glas in die Sterilbank transportiert und dort der Deckel zunächst mit groben Gummihandschuhen nur gelockert. So behandle ich mehrere Gläser vor. Dann wechsle ich auf sterile Handschuhe, öffne den Deckel und wische mit einem mit der 0,5%igen Lösung getränkten Papiertuch gründlich den Rand des Glases außen und im oberen Teil auch innen ab, Das Glas ist dann steril, ich habe nur extrem selten Infektionsprobleme wenn ich so umlege.

So werde ich auch die symbiotischen Gläser behandeln.

@Michael, das Thema Erlenmeyerkolben habe ich für mich zu Beginn ausgeschlossen. Ich habe Hunderte an Gläsern, Erlenmeyerkolben sind im Vergleich zu Rundgläsern sehr teuer, Gummistopfen auch. Das Problem mit der Verkeimung des Spalts zwischen Glas und Gummi löst du damit auch nicht, Gummistopfen könntest du meines Wissens auch nicht thermisch sterilisieren.

[Berthold]

...Das Glas ist dann steril, ich habe nur extrem selten Infektionsprobleme wenn ich so umlege.
So werde ich auch die symbiotischen Gläser behandeln.

ja, komplett eintauchen, das klingt plausibel. Ich sehe dazu keine Alternative. So ein Mist.

[Timm Willem]

Ich denke, dass größte Problem ist die Kondenswasserbildung in geschlossenen Behältern. Pilze können durch jede Form von Luftfilter durchwachsen, sobald dieser über lange Zeit feucht ist.
Ich lagere sehr viele Gläser in trocknen Kartons in der Wohnung für lange Zeiträume. Dabei gab es nie Probleme mit Kontaminationen. Alle Gläser stehen bei gleich bleibender Temperatur, die Filter sind ausgetrocknet(klar, kommt auch auf die Luftfeuchtigkeit an).
Ein anderer Aussäer hat die gleichen Gläser mit den gleichen Filtern in Plastikbeuteln bei schwankender Temperatur aufbewahrt. Er hatte sehr viele Kontaminationen.
Mir war nicht klar, dass die Lagerung so sensibel ist. Wenn ich Gläser erst nach einem Jahr umlege, ist meist eine Staubschicht auf den Deckeln, wenn sie nicht in Kartons gelagert waren, da wische ich zum Umlegen nicht mal den Staub ab, Probleme hatte ich nie.

[Claus]

Hallo Timm,
wir müssen jetzt mal unterscheiden zwischen asymbiotischer und symbiotischer Kultur. Wenn bei asymbiotischer Kultur eine Infektion eintritt, dann ist das Glas normalerweise in wenigen Tagen voll verschimmelt, und man schmeißt den Inhalt weg. Dann kann man nur noch überlegen, wie man diesen Mangel beim nächsten Mal vermeidet. Wir haben das ja bereits miteinander diskutiert, deine Filtermethode ist bei völlig trockenem Aufbewahren der Gläser gut, bei Aufbewahrung wie bei mir, z.B. auf dem Balkon mit stark wechselnden Temperaturen und Kondensation unter dem Deckel nicht besonders gut geeignet.

Bei der symbiotischen Kultur, bei der man ja normalerweise auf eine bereits im Glas etablierte Pilzhyphenschicht aussät oder umlegt, ist das leider anders. Da sieht man im Normalfall zunächst gar nichts. Dann gibt es vielleicht eine leichte Verfärbung des Agars in Richtung ocker oder bräunlich, dunkle Flecken, oder die Sämlinge sterben einfach mal ab. Meist hat sich dann auf der Oberfläche auch so ein zäher, suppiger Schleim gebildet. Nach sehr langen Zeiten, wenn der Symbiosepilz vielleicht nicht mehr so gut ernährt ist und schwächelt, treten kleine Stippen auf, weiß, grün oder blau. Erst dann weiß man, dass da eine Fremdinfektion mit Schimmel vorliegt.

Wenn man dann aus so einem Glas, in dem noch alles bestens zu laufen scheint und auch die Sämlinge noch gut wachsen, eine Probe entnimmt, um den Pilz weiter zu vermehren, bekommt man die Nebenprodukte gleich in die neuen Gläser mitgeliefert.

Eine weitere Gefahr besteht darin, auch bei einem sauberen Pilz, dass man bei der Entnahme von Pilzagar aus einem Glas gleich ein paar Sporen von der Oberfläche des Glases mit in die nächsten Gläser bekommt. Dann sieht man die Fremdinfektion früher, weil der Symbiosepilz in direkter Konkurrenz zum Schadpilz läuft. So bei mir gerade wieder geschehen, ich habe 50 Gläser verworfen, zum Glück noch nicht besät.

Es ist daher in jedem Fall erforderlich, dass man bei der Weitervermehrung das Glas, aus dem entnommen wird, außen chemisch desinfiziert. Außerdem muss man vor jeder Weitervermehrung das Glas, aus dem entnommen werden soll, längere Zeit beobachten, ich schätze mal mindestens 2-3 Monate. 

Ganz wichtig ist die Herstellung von mehreren Rückstellproben, wenn man sicher ist, dass die einwandfrei sind. Aufbewahrung im Kühlschrank praktisch unbegrenzt. Ich vermehre immer noch aus einer Rückstellprobe von April 2005, und nach Infektion laufen die Hyphen innerhalb von 1-2 Tagen wieder los.

Viele Grüße
Claus

[Berthold]

Mir war nicht klar, dass die Lagerung so sensibel ist. Wenn ich Gläser erst nach einem Jahr umlege, ist meist eine Staubschicht auf den Deckeln, wenn sie nicht in Kartons gelagert waren, da wische ich zum Umlegen nicht mal den Staub ab, Probleme hatte ich nie.

dann verschliesse die Gläser nach der Entnahme einiger Sämlinge wieder und schau, ob sie steril bleiben. Das ist ja genau unser Problem, dass man aus einem Pilzmutterglas mehrmals in grösseren Zeitabständen Proben entnimmt und es dabei öffnen und wieder verschliessen muss. Der Staub von aussen darf halt dabei nicht nach innen kommen.

[Timm Willem]

Mir war nicht klar, dass die Lagerung so sensibel ist. Wenn ich Gläser erst nach einem Jahr umlege, ist meist eine Staubschicht auf den Deckeln, wenn sie nicht in Kartons gelagert waren, da wische ich zum Umlegen nicht mal den Staub ab, Probleme hatte ich nie.

dann verschliesse die Gläser nach der Entnahme einiger Sämlinge wieder und schau, ob sie steril bleiben. Das ist ja genau unser Problem, dass man aus einem Pilzmutterglas mehrmals in grösseren Zeitabständen Proben entnimmt und es dabei öffnen und wieder verschliessen muss. Der Staub von aussen darf halt dabei nicht nach innen kommen.

Berthold, ich habe sterile Aussaaten von calceolus aus KW 31/2008, die Gläser wurden drei bis vier mal geöffnet um die Sämlinge zu ernten, da gibt es keine Kontamination.
Der Staub darf nicht in die Gläser kommen, das ist klar. Es ist aber ein Fehler sich bildlich Mengen von Sporen vorzustellen, die durch leichte Bewegung direkt ins offene Glas fliegen, da spielt die Umlegetechnik auch eine große Rolle. Die Luft ist normalerweise nicht stark belastet, der Mist klebt aber an allen Oberflächen.

[Timm Willem]

Hallo Timm,
wir müssen jetzt mal unterscheiden zwischen asymbiotischer und symbiotischer Kultur. Wenn bei asymbiotischer Kultur eine Infektion eintritt, dann ist das Glas normalerweise in wenigen Tagen voll verschimmelt, und man schmeißt den Inhalt weg. Dann kann man nur noch überlegen, wie man diesen Mangel beim nächsten Mal vermeidet. Wir haben das ja bereits miteinander diskutiert, deine Filtermethode ist bei völlig trockenem Aufbewahren der Gläser gut, bei Aufbewahrung wie bei mir, z.B. auf dem Balkon mit stark wechselnden Temperaturen und Kondensation unter dem Deckel nicht besonders gut geeignet.

Bei der symbiotischen Kultur, bei der man ja normalerweise auf eine bereits im Glas etablierte Pilzhyphenschicht aussät oder umlegt, ist das leider anders. Da sieht man im Normalfall zunächst gar nichts. Dann gibt es vielleicht eine leichte Verfärbung des Agars in Richtung ocker oder bräunlich, dunkle Flecken, oder die Sämlinge sterben einfach mal ab. Meist hat sich dann auf der Oberfläche auch so ein zäher, suppiger Schleim gebildet. Nach sehr langen Zeiten, wenn der Symbiosepilz vielleicht nicht mehr so gut ernährt ist und schwächelt, treten kleine Stippen auf, weiß, grün oder blau. Erst dann weiß man, dass da eine Fremdinfektion mit Schimmel vorliegt.

Wenn man dann aus so einem Glas, in dem noch alles bestens zu laufen scheint und auch die Sämlinge noch gut wachsen, eine Probe entnimmt, um den Pilz weiter zu vermehren, bekommt man die Nebenprodukte gleich in die neuen Gläser mitgeliefert.

Eine weitere Gefahr besteht darin, auch bei einem sauberen Pilz, dass man bei der Entnahme von Pilzagar aus einem Glas gleich ein paar Sporen von der Oberfläche des Glases mit in die nächsten Gläser bekommt. Dann sieht man die Fremdinfektion früher, weil der Symbiosepilz in direkter Konkurrenz zum Schadpilz läuft. So bei mir gerade wieder geschehen, ich habe 50 Gläser verworfen, zum Glück noch nicht besät.

Es ist daher in jedem Fall erforderlich, dass man bei der Weitervermehrung das Glas, aus dem entnommen wird, außen chemisch desinfiziert. Außerdem muss man vor jeder Weitervermehrung das Glas, aus dem entnommen werden soll, längere Zeit beobachten, ich schätze mal mindestens 2-3 Monate. 

Ganz wichtig ist die Herstellung von mehreren Rückstellproben, wenn man sicher ist, dass die einwandfrei sind. Aufbewahrung im Kühlschrank praktisch unbegrenzt. Ich vermehre immer noch aus einer Rückstellprobe von April 2005, und nach Infektion laufen die Hyphen innerhalb von 1-2 Tagen wieder los.

Viele Grüße
Claus

Hallo Claus,
das sind doch aber alles Beispiel, bei denen eine mögliche Ursache in der unbemerkten Vermehrung bereits kontaminierter Kulturen gesehen werden kann.

Das ist aber unabhängig von einer äußerlichen Desinfektion der Gläser.

Ich meine es geht schon um Arbeiten in der Sterilbank. Mein größtes Problem, sind die meist 20 cm langen Wurzeln der Sämlinge, die sehr beim umlegen stören. Mit kleineren Sachen hatte ich nie Probleme.
Ich bin da in meiner Familie nicht der einzige mit dem Sterilquatschhobby, die anderen matschten da mit Bakterien rum, mir sträuben sich die Nackenhaare, aber alles bleibt irgendwie sauber.
Frank hat doch früher auch ohne Sterilbank mit B1 hantiert, oder? Wenn das ein Gemisch ist, treten die anderen früher oder später ans Licht.
Viele Grüße
Timm