Hallo!
Nach Rücksprache mit der Uni hab ich nun das OK für die Sequenzierung von B1 bekommen! :thumb
Das heißt ich brauche von euch mal ein Glas das möglichst dicht mit dem Pilz besiedelt und nicht kontaminiert ist, am besten zur Sicherheit gleich 2-3.
Und von dem ihr euch sicher seid dass es jener B1 ist!
Interessant wäre natürlich wenn sich zurückverfolgen ließe woher das Isolat nun wirklich stammt, ich habe nur den Hinweis B1 was isolated from a Dactylorhiza fuchsii in middle England by someone in the Hardy Orchid Society. (http://culturesheet.org/mycorrhiza:tulasnella#fn__1) gefunden.
LG,
Christian
Hallo Christian,
was heißt "möglichst dicht besiedelt"? Am dichtesten bekommst du den B1, wenn du die Haferflockenkonzentration z.B. auf 15 g/l bringst, dann würde er zwar parasitieren, aber da er nichts zum parasitieren hat, bildet er lediglich ein dichtes Fasergewirr von Hyphen. Bei der DSMZ wird auf Haferagar mit 30 g/l vermehrt.
Ich hätte ihn zur Zeit auf dem üblichen Haferagar, auf dem sicherheitshalber Protokorme von D. maculata sehr gut wachsen, könnte dir aber auch ein Präparat wie oben geschildert herstellen.
Welche Menge brauchst du?
Viele Grüße
Claus
Hallo Claus!
Naja, für die Sequenzierung wird nur eine winzige Menge Substanz (Nadelspitze) benötigt. Ist ein Glas nur teilweise oder allzu dünn besiedelt wirds natürlich schwer da gezielt was rauszufischen sodass sich der Pilz auch sicher im Sample befindet - und ein aufreinigen möchte ich mir sparen...
Wenn man die Hyphen deutlich erkennen kann sollte es passen. Ich habe ja noch nie mit B1 gearbeitet und weiß nicht wie dicht er normalerweise in den Gläsern wächst.
Auch wären zumindest 2 Gläser (können ruhig klein sein) nicht schlecht falls beim 1. Mal was nicht klappt hab ich noch eine 2. sterile Probe.
Ich schick dir noch ne PM...
LG,
Christian
Hallo Christian,
der B1 bildet ja sog. Langhyphen, d.h. die Hyphen laufen im Normalfall immer in der Oberfläche des Nährbodens und dringen dann später allmählich in den Nährboden ein. Da sieht man sie natürlich nicht, aber man kann das Eindringen an einer Veränderung des Brechungsindex des Nährbodens erkennen. Sie laufen auch ein Stück an der Glaswand empor, weil dort vom Sterilisieren her auch noch geringe Mengen Haferagar kleben. Auf der Oberfläche des Agars befindet sich auch immer eine gewisse "Suppenschicht".
Man kann also die Hyphen nicht einfach als Reinsubstanz fassen, sondern man erhält immer etwas vom Haferagar mit. Macht das was?
Sonst würde ich doch erst einmal den Pilz mit hohem Gehalt an Hafer anzüchten; denn dann bilden sich auch Lufthyphen, die man als Reinsubstanz erfassen kann. Das dauert aber etwas.
Ich könnte auch beides liefern.
Ergänzung: Auf alten Kulturen des B1 befinden sich immer Konidien als gelbliche Knubbel. Die könnten natürlich weniger vom Hafer enthalten. Hätte ich auch da.
Viele Grüße
Claus
Hallo Claus!
Nein, solange es nur der Haferflockenagar ist macht es gar nichts wenn er mit in der Probe ist, da sollte nichts inhibierendes drinnen sein.
Interessant wären aber die angesprochenen Konidien, da ließe sich auch morphologisch was machen. Bitte schick mir auf jeden Fall ein Glas davon.
Ansonsten - wiegesagt, es geht nur darum dass man die Hyphen findet und nicht ne Probe sequenziert wo gar kein Pilz drinnen ist.
Bin schon gespannt was da rauskommt...
LG,
Christian
Hallo Christian,
ich finde das wirklich spannend. Wenn man eine Sequenzierung macht, bekommt man doch eine Reihenfolge für die Basenpaare je nach Laufrichtung(ATGCGT...Blabla). Dann kann man doch die Sequenz mit den ganzen in der Welt vorhandenen Sequenzierdaten vergleichen und hat dann sehr schnell den genauen Namen der Art, eventuell sogar die genaue Herkunft??? Sind den wirklich schon alle Pilzarten sequenziert, oder besteht die Gefahr, dass es ein ganz neuer Pilz ist?
Wie lange dauert es dann die gefundene Sequenz mit anderen zu vergleichen? Kann man die Daten aus dem Netz bekommen?
Viele Grüße
Timm
Zitat von: Timm Willem am 28.Feb.09 um 20:27 Uhr
Sind den wirklich schon alle Pilzarten sequenziert, oder besteht die Gefahr, dass es ein ganz neuer Pilz ist?
Ich nehme mal an das es eine neue Art ist.
Inwieweit sämtliche Pilze auf unserem Globus Sequenziert wurde ist mir nicht geläufig, aber ich glaube wohl kaum das es schon mehr als 1% sind.
Hallo Michael,
ich vermute, dass es bei dieser Frage um die Zuordnungskriterien geht. Wahrscheinlich ist es ein noch nicht beschriebener Klon(es gibt auch anders lautende Gerüchte). Das schließt aber nicht aus, dass man B1 durch die Erkenntnisse aus der Sequenzierung sehr nah zu einer bekannten Art oder Gruppe zuordnen kann. Möglicherweise ist die Enttäuschung dann groß, wenn die nächsten Verwandten als Orchideenkeimer nicht so erfolgreich sind wie B1, was ja denkbar ist, da B1 bis jetzt sehr erfolgreich war(ein echter evolutionärer Vorteil, solange er die Orchideen gut keimt, halten wir seine ökologische Nische in unseren Gläsern offen).
Was ist denn der nächste Schritt, wenn man die Sequenz von B1 herausgefunden hat? Wo kann man das dann abgleichen?
Viele Grüße
Timm
Zitat von: Timm Willem am 01.Mär.09 um 00:27 Uhr
Möglicherweise ist die Enttäuschung dann groß, wenn die nächsten Verwandten als Orchideenkeimer nicht so erfolgreich sind wie B1, was ja denkbar ist, da B1 bis jetzt sehr erfolgreich war(ein echter evolutionärer Vorteil, solange er die Orchideen gut keimt, halten wir seine ökologische Nische in unseren Gläsern offen).
Viele Grüße
Timm
Nach meinen Erfahrungen gibt es auch bei dem B1 Pilzindividuen, die 10% des Samens im Glas, andere 1% und wieder andere nur 0.1% keimen können. Ich weiss leider auch nicht wie stabil der Pilz genetisch ist und ob er schon nach 5 maliger Neuanzucht (also etwa 1 Jahr) vom "Top-Keimer" zum "Nichtkeimer" mutieren kann.
Es gibt eine Arbeit (hat Phil hier eingestellt, finde sie aber auf die Schnelle nicht), in der wurde u. a. die Keimfähigkeit eines Pilzes an australischen Erdorchideen untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass Pilze der selben Art aber von unterschiedlichen Herkunftsorten sehr unterschiedliche Keimfähigkeit besaassen.
Ich hatte ja schonmal versprochen was zu Ablauf und Ergebnis einer Sequenzierung zu schreiben, also hier mal um die meisten Fragen zu klären...
Wir nehmen eine winzige Probe die den Pilz enthält und sequenzieren sie mittels Didesoxymethode nach Sanger (http://de.wikipedia.org/wiki/DNA-Sequenzierung#Didesoxymethode_nach_Sanger).
Dazu werden Primer (http://de.wikipedia.org/wiki/Primer) für ITS1 (https://secure.wikimedia.org/wikipedia/en/wiki/Internal_transcribed_spacer) also die nicht für Gene codierende DNA Region zwischen den Genen für 2 rRNAs eingesetzt. Da der DNA-Abschnitt keine Funktion erfüllt und Mutationen dort folgenlos bleiben verändert er sich entsprechend rasch und kann auch zur Unterscheidung sehr nah verwandter Organismen oder sogar Subspezies eingesetzt werden.
Heraus kommt ein Chromatogramm (http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Datei:DNA_sequencing_interferogram.gif&filetimestamp=20070520135343) welches sich in eine Basenabfolge umrechnen lässt.
Im Falle eines aus den hohlen Bulben von Caularthron bilamellatum isolierten Pilzes sieht das so aus: Caularthron_endophyte1.txt (http://www.unet.univie.ac.at/~a0204611/images/Orchideenforum/Caularthron_endophyte1.txt)
Die Sequenz kann man nun mit verschiedenen Datenbanken vergleichen, eine der größten ist die Nucleotide collection des NCBI welche man online mit dem Tool BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?PAGE=Nucleotides&PROGRAM=blastn&MEGABLAST=on&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome) durchsuchen kann.
Probiert es aus, einfach den Inhalt des Textdokuments in das Enter Search Query Fenster der Seite kopieren, als Datenbank Nucleotide Collection auswählen, als Program Selection Somewhat similar sequences wählen und auf BLAST klicken.
Wie man sieht bekommt man eine Fülle von Ergebnissen mit dem jeweiligen Alignment zwischen der eigenen und einer Datenbank-Sequenz.
Der Teufel steckt wie immer im Detail, wie aussagekräftig das was rauskommt ist hängt erheblich von den Parametern ab welche man dem Programm vorgibt (bei Programmen zur Stammbaumerstellung noch wesentlich komplexer).
Aber schon bei dieser simpelsten Demonstration kann man den Pilz in die Verwandtschaft um Clavariadelphus einordnen.
Man sieht aber dass es keine Sequenzen gibt die ident mit dem Pilz sind, das ist bei einer Umweltprobe aus den Tropen aber auch nicht zu erwarten. Zu B1 wird man mehr ähnliche Sequenzen finden denke ich mal.
Man darf aber auf keinen Fall annehmen dass so eine willkürlich gewählte genetische Identität etwas über die Funktion des Organismus aussagt. Wie ihr schon erwähnt habt mutieren Pilze (wenn auch nicht so extrem wie Bakterien) relativ rasch und können verschiedenste ökologische Nischen besetzen und Stoffwechselwege betreiben obwohl sie die selbe "Art" sind. Auch verlieren sie nicht benötigte Gene wenn man sie zu lange auf einem Vollmedium kultiviert. Dementsprechend wäre mit Sicherheit auch ein B1 Stamm den man längere Zeit "asymbiotisch" kultiviert nicht mehr zur Keimung von Samen zu gebrauchen.
Naja, ich bin schon gespannt was rauskommt, ideal wäre natürlich falls auch eine morphologische Zuordnung von B1 möglich wäre.
LG,
Christian
Sorry for posting in English ... I read & speak German but writing is a problem.
Hi Christian,
I'm interested to read about your results. I sent a culture of the B1 to the University of Torino, Italy for identification (last year). I just mailed them and hopefully I'll have an answer by the end of the week.
kind regards,
Fred (the one from terrorchid.org)
Hello Fred,
nice to meet You here. We are also interested here in Your Mykorrhiza-Germination experiment.
Greetings Berthold
Hi everybody!
Are there any news on the identity of our famous B1-strain?
Gibt's was neues zur Identität unseres so heißgeliebten B1?
Erwin
Hallo!
In Wien nichts neues, so far...
Es gibt momentan einen ziemlichen Probenrückstau sodass es noch 1-2 Wochen dauern könnte bis der Pilz sequenziert ist.
Rafael hat in Ingrids Forum gepostet dass er einige Pilze - darunter B1 - sequenziert hat, leider hat er auf meine PN nicht geantwortet.
LG,
Christian
Zitat von: Ahriman am 02.Apr.09 um 01:46 Uhr
Rafael hat in Ingrids Forum gepostet dass er einige Pilze - darunter B1 - sequenziert hat, leider hat er auf meine PN nicht geantwortet.
Jaja, das wollte er schon lange mal gemacht haben.
Aber irgendwie ist das dann im Sande verlaufen.
wir arbeiten sehr langsam :D Der T&M ist sequenziert. Die anderen, unter anderem der B1 kommen als nächstes. Allerdings müssen die Pilze erst in einer Arbeit publiziert werden, das ist die Auflage der Fachstelle.
Liebe Grüsse aus der Schweiz,
Rafael
Howdy,
The answer is in, but you're not going to like it.
According to Michele Rodda, they were only able to identify it up to genus level, and it seems to lie in Ceratobasidium (most people think it's Tulasnella).
Zitat
Hi Fred,
here is the sequence for B1:
ACCATATGACATGCTCTCCGAATGAATAGACGATTAGAACGCGGTTACTCCGCACTCCCGGCCCCTTTAGCACGTGTCCTCAGCGAGTGATACTTATCACGCCGGAGTGGAAACCGGAGCTCACTGGAGGATCCAGCTAATTTATTTAAGAGGAGCAGACGTGAATCTGCAGACCTCCAAGTCCAAAATAAATTCAATCGAATGAACNAAGAATTATTTTGATAATTTCATGATACTCNCAGGCATGCTCCANGGAATACCANGGAGCGCAAGGTGCGTTCNGATTCGATGATTCCTGAATTCTGCNATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAG
Using http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi as a
database to try to give a name to B1 I found out that the
only closely related species appear to be Ceratobasidium.
The colony morphology also reminds me of Ceratobasidium
since it is quite woolly. Usually Tulasnellas grow more
sparsely and more appressed to the medium.
I tried to germinate seeds of 5 orchid species with B1:
Anacamptis morio, laxiflora, Ophrys fuciflora, Orchis
Purpurea, Serapias vomeracea. None of these produced
protocorms, despite the fact that usually I can germinate
at least A. morio and S. vomeracea with a wide range of
fungal isolates, obtained from many different orchid
species.
I am soon publishing my results on germination of
mediterranean orchid species but I will not include B1
since the results were not good.
Sincerely, Michele
regards,
Fred
High Fred,
is it sure that he got the right fungus? O. morio is very easy to propagate with B1??
Ob das wiklich B1 ist der da sequenziert wurde? O. morio sollte doch sehr gut keimen mit B1 :ka
Viele Grüße
Niko
Nicht sollte, Orchis (Anacamptis) morio keimt sehr gut mit B1.
Zitat von: Niko am 21.Jun.09 um 20:03 Uhr
High Fred,
is it sure that he got the right fungus? O. morio is very easy to propagate with B1??
Viele Grüße
Niko
Fred, maybe that Michele got the wrong individuum of B1. Not all B1-fungi are good germinators. You have to select the best germinator all the time.
My B1-fungi are best germinators for the Orchis laxiflora-group, the fastes of all orchids.
Nicht nur Orchis morio sondern auch Orchis longicornu keimt gut auf B1.
Greetings
Berthold
Hi Fred,
B1 doesn't grow woolly but grows very much appressed to the media, like Michele wrote for Tulasnella. From which source was the sample Michele wrote about? All the details about germinating seeds doesn't fit to B1.
Greetings
Claus
Von dem B1 habe ich Fred in 2008 was geschickt.
Gruß Volzotan
Hi all,
I'm as puzzled as the rest of you.
Could anyone post a photograph of the B1 in an "old" culture where it developed well ?
regards,
Fred
Hi Fred,
that's not easy, because you can see the hyphae only under a certain angle of view. I have cultures of B1 and other fungus on active coal containing oat agar, where the contrast is a bit higher.
On the first picture you can see the hyphae on the glass wall of the vessel, the second picture shows a little bit also from the surface, but as I said, hyphae on surfaces are very difficult to show.
Greetings
Claus
I think we can conclude that it's contamination. What I have labelled as B1 doesn't look like the picture, it forms small coils between the strands of hyphae:
(http://culturesheet.org/_media/mycorrhiza:orchid:b1_closer.jpg)
Looks like Christian will have the honour of identifying it.
My B1 forms coils in older cultures, I think it is still uncontaminated.
Roman, thanks for posting that picture. I recognise it immediately from my oldest culture. It was then 7+ months old, 20g/l which was too much but I kept it to see if anything funky would come out of it:
(http://culturesheet.org/_media/mycorrhiza:orchid:b1_horizon.jpg)
The brown colour is due to the red table (http://culturesheet.org/_media/mycorrhiza:orchid:oma_ingredients.jpg) and the flash, btw.
I received your parcel on March 20 2008 and took a sample from which my cultures are grown. According to my PMs I sent it to Michele the next day on the 21th. So the contamination must have happened by me during sampling, which is odd because it was done in a glovebox in an ISO 1 cleanroom.
Also ganz unerwartet ist das Ergebnis eigentlich nicht.
Den Papern von Hadley folgend zeigt T. calospora doch ganz deutlich eine Notwendigkeit für ganz bestimmte Nahrungszusätze (organisches Eiweiß, PABA, Thiamin) und eine deutliche Response, wenn es selbige auch bekommt (was bei Ceratobasidium nicht der Fall ist). T. calospora tut sich ferner teils wesentlich schwerer mit Zelluloseabbau als Ceratobasidium während von denen, die es versucht haben durchgehend bestätigt wird, dass B1 auf holzbasierten Substraten wesentlich wüchsiger ist wohingegen Hadley zur Beobachtung von Tulasnella auf Zellulose basierten Medien schreibt, dass sie sich dort schwächer wüchsig verhält. Leider sind das die einzigen Arbeiten, die ich zu dem Thema finden konnte, aber die machen den Outcome der Sequenzierung eher plausibel denn unglaubwürdiger.
Sorry, forgot to mention it's OMA in the last picture.
Michele used malt-agar and in liquid culture to grow it before sequencing.
Well, the pictures from Roman, Fred and myself are typical for B1 of different ages. My culture was infected on June 10th, so it's still very fresh an doesn't show the typical sclerotia of older sammples.
The "spoiled" sammple looks like some of mine, when I didn't care enough about sterility. Since then I handle all that stuff only in a clean bench.
Hello!
Unfortunately our first attempt to identify B1 totally failed due to PCR problems.
I will receive new cultures from Claus soon, then we'll see if we can solve the mistery.
Regards,
Christian
Probably a useless question, but ...
Is it possible that our B1 culture isn't pure ? I.e. it contains Tulasnella + Ceratobasidium ?
These are the reasons I'm asking:
- - when starting a new culture on a strong medium (20g/l and more), I always see a (sparse) fluffy white ring growing out of the innoculation. This only lasts a few days and then collapses into the appressed culture we know
- - This is what's really bugging me: what's the chance that I accidentally contaminated the culture with Ceratobasidium, a mycorrhizal genus ? In a microelectronics clean room ?
- - There is no data on the isolation of B1 apart that it was done from Dactylorhiza fuchsii roots by someone in the HOS. Ceratobasidium can also be found in roots of this species.
My "theory": B1 = Tulasnella (germinator) + Ceratobasidium (not a germinator)
Fred,
that's possible. I got a fungus, let's call it D1, which contains at minimum three individual species, a mould, a symbiotic fungus and a third one with only hyphae in the air. Despite there is a mould in the mixture it germinates quite a lot of orchid seeds.
Besides my trials to grow asymbiotic cultures I try to separate these three individuals. Maybe that I was already successful with the air hyphae, because I picked one very tiny part directly from the air, and the new culture is now, only four days later, already again "in the air". Maybe I also separated the symbiotic part, as it is appressed to the surface, and I got a part from that area short after infecting the agar.
I also know the fluffy structure form the B1 when the concentration of oat exceeds about 10 g/l, but I thought this occurs when the fungus becomes parasitic.
Well, what to do? There is a possibility to pick up very tiny parts of the agar from the front of the hyphae short after infection (about one day). But when two individuals run with the same speed the a separation is not possible.
Do you have other ideas?
Greetings Claus
The thought of B1 consisting of two fungi is quite an interesting theory, Claus, BUT even if this is the case, fred should at least have been able to germinate Anacamptis morio. Instead of that he got a total failure in his trial-germinations. If the fungus, that fred received is composed of Tulasnella AND Ceratobasidium, he should have had success in germinating some of the mentioned species. Therefore this is currently not an acceptable theory for me (from a logical point of view) and we should first try to find the answer why there were no germinations.
Fred, what kind of medium did you use for germinating the mentioned species with the B1?
Kind regards
Erwin
Winwen,
It's not me who is having problems germinating these orchids, it's Michele who wanted to do the identification/sequencing. My B1 comes from Roman, I took a sample from which my cultures are grown and I sent the vial to Michele. He isolated a fungus, sequenced it and got Ceratobasidium. He tested it as a germinator and it failed. That's the problem: my sample works, he isolated something which doesn't work. Sorry for the confusion.
Claus,
very interesting info you've given. Now you mention air hyphae, my old cultures have hyphae which run to the top of the jar and don't form these coils/clusters like at the bottom - I think the fast aerial one is Ceratobasidium. I've just taken a sample from these "aerial" hyphae and I'm interested to see what'll come out. It's in a 30g/l OMA so we'll know this weekend. I also have jars with other media (rye agar, with and without dextrins) so maybe it's possible to provide a condition where the Tulasnella grows faster than the other and isolate it.
Hello!
Just some more thoughts:
Usually if you try to sequence a mixture of fungi with universal primers you get some unreadable mess in the chromatogram.
Since Michele obviously got some results (using which PCR primers?) this would be a point against the mixture-hypothesis.
However, fungal standard-primers often don't work well with Tulasnellales so it may happen that you don't find them even if they are there and detect some contamination instead.
If somenthing similar happens in our 2nd attempt I'll use specific primers for Tulasnellales and Ceratobasidiales, this should shed some light oh this issue.
Claus:
In order to seperate such mixtures I'd try to grow them on stress-inducing media, varying pH, salinity and content of essential nutrients.
If you can create conditions that one component can tolerate but not the others you should be successful.
Anyway I find it astonishing that such associations remain stable. Usualy I would expect fungi to compete with or even attack each other if conditions are less favorable.
Unless they have formed some symbiotic relationship among themselves?
Regards,
Christian
Hi Christian,
could you shed some light on how exactly you process the culture for sequencing? If I understand correctly they're grown in a floating culture, then washed and processed for sequencing. But when you receive a culture on agar, do you first isolate single hyphae under the microscope or do you cut out a piece of the agar and assume it's pure? I've sent a link of this discussion to Michele, maybe he will join and answer some questions.
Claus,
In addition to the tips given by Christian, some literature reports that different fungi have a different optimum growing speed in relation to the temperature. Example (Perfect states of Rhizoctonias associated with orchids, Warcup & Talbot 1967): Ceratobasidium obscurum grows optimal at 15-20°C, C. cornigerum at 25°C. It's a simple variable to experiment with.
As a last question, would anybody be interested in running the same experiment as I am for verification? I took a sample from the B1 hyphae growing near the top of a jar (near the lid) in an old culture and put it on 30g/l OMA. Even if I get something different than "normal" B1 it could still be caused by contamination from me. If it's as simple as I think it is we could solve this puzzle quite quickly.
regards,
Fred
Hi Fred and Christian,
separating different species of fungus seems to be not my main work. I tried this, because I was curious which species of Dieters D1-mixture will be the "good" one or is the mixture essential? Such a mixture is obvious in natural environment.
If you put a fresh sample of Dieters mixture on a fresh agar, then you get different kinds of surfaces, parts where the surface becomes hydrophobic in the first days, parts where you can see hyphae appressed to the surface and finally some first white, later blue green spots.
Finally one of these species dominates the surface. As I'm in an advanced stage, I infect new vessels normally not with pieces of agar but with germinated protocorms, and you could see different developments on the surface dependent of the single protocorm. It's my opinion that the protocorm, grown on an infected agar, contains at minimum the symbiotic fungus, so the chance to get the right one seems to be higher.
For the time being I have different vessels with different stages of development and with the chance, I already have the right one.
It is obvious that I'm not able with my limited resources to vary also the conditions of temperature and components in the agar, as I'm concentrated on the propagation of rare orchid species mainly on asymbiotic media. For my work the symbiotic propagation is only interesting because the development of seedlings is much faster – if it works.
The next time I prepare fresh oat agar I will cook also 30 g/l and infect it with a single hyphae from an appropriate location.
Greetings
Claus
Zitat von: Ahriman am 24.Jun.09 um 03:48 Uhr
Claus:
In order to seperate such mixtures I'd try to grow them on stress-inducing media, varying pH, salinity and content of essential nutrients.
If you can create conditions that one component can tolerate but not the others you should be successful.
Regards,
Christian
Christian that's a fine idea but is doesn't sound easy to find the conditions to stress the
right fungus only
Berthold, I assume you want to grow the right fungus only and stress the others. grins
Anyway, I guess it's just trial & error and much, much work.
Claus, I know what you mean - it's not my main work either, I never found time to really experiment with symbiotic germination at all...
Fred, to make it clear I am neither Mycologist nor an exprt for sequencing procedures but a student of chemical ecology. I just do this because I find it an interesting idea...
The B1 samples were not processed but directly sequenced out of agar as there were visibly sclerotia present that could easily be removed.
But I did't do this part myself so I cannot tell you more - I will do all steps myself mext time, so if it goes wrong again at least I know it's my fault. :whistle
Regards,
Christian
Christian,
I forwarded some of the questions to Michele:
Regarding the possibility of B1 = mix of fungi:
ZitatThat may be possible, but I think it is quite remote since
usually fungi do not grow together without taking over,
even on oat meal agar.
In my opinion if a mix up happened, the Ceratobasidium is
most likely to lose the battle since usually it does not
cover the agar surface as quickly as the Tulasnella
(usually, then I have seen very aggressive Ceratobasidium
but usually have dark hyphae).
If two fungi were present in the culture that I used to
make the DNA extraction, I would have not been able to
have a clear DNA sequence, so, if there is a mix up I may
only have the one fungus left (strangely the
Ceratobasidium).
I have to admit that the general morphology of the colony
that I have is more Tulasnella than Ceratobasidium-like.
Still in the recent past I have seen many Ceratobasidium
looking Tulasnella and many Tulasnella looking
Ceratobasidium.
To be absolutely sure that no further mix up happened in
my laboratory I will re-perform sequencing on the culture.
Regarding O. morio germination failure:
ZitatI only tried a germination
experiment with B1 once, and I may need to re-test it,
maybe with different orchid species.
Regarding rich OMA vs malt agar:
ZitatI never used so rich oatmeal, so I cannot make comparisons
with my culture.
I will try to re-inoculate it on fresh oatmeal and see
what happens.
Generally speaking Ceratobasidium develop quite woolly
colonies, either whitish yellow or brown. Tulasnella
instead appear very flat on the medium, often mucid and
yellowish only. The picture that you sent me looks like a
Ceratobasidium to me.
Regarding Christian's question on the PCR primers:
ZitatI am aware that many primers commonly used for ITS
amplification of fungi do not work well on the Tulasnella
calospora group.
Till a few years ago all isolates (and all direct root
amplifications) in my lab were PCR amplified using ITS1F-
ITS4, but with poor results on some strains (likely of T.
calospora). Other primers used were ITS1Tul and ITS4B, but
again with poor results.
At the moment we are using ITS1OF A+B--ITS4OF for direct
amplification from root and ITS1-ITS4 for isolates.
Sometimes, when the chromatogram is unreadable we clone in
PgemT, but this is a rare occasion. It is more likely that
the need for cloning is due to the dicaryon in the fungus
itself than a mix of two fungi.
Did you [Christian] get contrasting results from the other sequencing
of B1?
regards,
Fred
Hello!
I agree with Michele - as far as I understand :-D
Morphology and genetic identity are two very diffrent things in fungi. Not as weird as in bacteria but still very confusing.
I did and will not attempt any cloning as that's too much work for me, I'd rather grow orchids invitro in my spare time...
But what does he mean with contrasting results?
I only did one sequencing attempt which failed in all samples, possibly DNA Polymerase had turned bad.
It's funny that by now at least 3 people are working on sequencing B1 but so far noone seems to have been successful :whistle
Regards,
Christian
Zitat von: Ahriman am 27.Jun.09 um 03:18 Uhr
It's funny that by now at least 3 people are working on sequencing B1 but so far noone seems to have been successful :whistle
Regards,
Christian
Yes, but unfortunately Rafael successfully sequenzed the T&M and not the B1. And what is worse, we don't hear anything of him since weeks.
Claus
As promissed, a culture of the aerial hyphae ...
(http://culturesheet.org/_media/mycorrhiza:orchid:b1_aerial_sample.jpg)
Some explanation:
To sample the 'aerial' hyphae I used a little piece of agar and pushed it against the top of an old jar - it's a trick to get hold of those few hyphae. That's why you see that small chunk in the center.
The fungus clearly develops a woolly growth, which becomes appressed later on. The ring is about 4 cm in diameter. This is different from my typical B1 cultures which only shows this behaviour during the first few days and then only grows as a mucus. The second thing I noticed is that it's completely white ... my B1 is normally yellowish at the appressed stage.
The piece of dust is because I removed the lid and photographed directly above the culture - the glass blurred my other photographs. I have 2 other cultures running which I keep closed. I'll let them develop to see if they also grow the 'coils' at the edge of the jar.
Fred the woolly hyphae are from a fungus that does not germinate any orchid. I am very familiar with this species of fungus and I throw it away immediately when I detect it.
Thanks Berthold,
if that's the case then there's little doubt that my culture contains 2 fungi and this is probably the Ceratobasidium sequenced by Michele. The question which remains in that case is: is it a contamination from me, or is this present in everybody's B1 ?
Zitat von: fred am 28.Jun.09 um 13:29 Uhr
is it a contamination from me, or is this present in everybody's B1 ?
Fred, my B1 is from the same source finally and I miss it in most of my flasks
Zitat von: Berthold am 28.Jun.09 um 13:41 Uhr
Fred, my B1 is from the same source finally and I miss it in most of my flasks
....you miss it in most of your flasks, berthold, but not in all and since you wrote, that you are familiar with this kind of fungus, won't you find it highly unlikely that fred or michele contaminated their sample with the same fungus?
If your really miss it in most of your flasks, wouldn't that indicate that
1.) our B1 is a mixture and
2.) the germinating component is the usually stronger? (which would confirm what michele wrote about the behaviour of tulasnella and ceratobasidium in co-culture)
If this really is the case, an interesting question would be what made the contamination growing so strong? The medium?
Zitat von: winwen am 28.Jun.09 um 22:06 Uhr
If your really miss it in most of your flasks, wouldn't that indicate that
1.) our B1 is a mixture and
2.) the germinating component is the usually stronger? (which would confirm what michele wrote about the behaviour of tulasnella and ceratobasidium in co-culture)
If this really is the case, an interesting question would be what made the contamination growing so strong? The medium?
if our B1 is a mixture I would have it in all my flasks but that's not the case (I "missed" it in most flasks).
I returned to the singl component oat flakes agar for better identification of contamination and I found this woolly fungus on oatflake agar. I think it's just a widespread fungus.
Example: Orchis longicornu on 2,5g/l oat flakes agar, 5 weeks old
straight B1:
(http://farm3.static.flickr.com/2630/3681740866_8efb3e6e44_o.jpg)
contaminated B1:
(http://farm3.static.flickr.com/2621/3680926321_a6a8d6ab79_o.jpg)
Protocorm developement started in the same way as in straight B1 but after 4 weeks increase of the protocorms will be moderated
Erst nach dem Urlaub kam ich jetzt dazu, das Juli-Heft der HOS durchzublättern. Wir hatten ja den B1 als Tulasnella eingestuft.
Tony Heys hat jetzt einen Artikel verfasst mit dem Titel: "The B1 Fungus is a Ceratobasidium". Damit ist unsere Frage nach der Sequenzierung dieses Pilzes auch beantwortet. Vielleicht noch wissenswert, weil immer mal gefragt, der B1 wurde von Jim Hill aus der Wurzel einer Dactylorhiza fuchsii isoliert, was er 1997 im Heft der HOS auch beschrieben hatte: "Hill, J. (1997) Symbiotic culture of hardy orchid seedlings. The Hardy Orchid Society Newsletter 5: 14-16".
Tony beschreibt da auch, dass es von Ceratobasidium sexuelle Fruchtformen gibt. Die von Orchideen genutzten Pilze erscheinen an sich nur in der asexuellen (anamorphen) Form und nicht in der sexuellen (teleomorphen) Form. Die Teleomorphe könne man aber manchmal auf Holz als weißen oder grauen Bewuchs sehen.
Als Anregung vielleicht für junge Forscher, ich halte die Kultivierung von Orchideen-Sämlingen mit diesem oder einem anderen Pilz auf Holz-Substrat für eine sehr lohnende Aufgabe. Da Holz aber nur sehr wenig mineralische Stoffe enthält muss man diese in Form einer Imprägnierung zufügen, z.B. in Form handelsüblicher Dünger. Natürlich muss man das Substrat auch vor der Infektion mit dem Pilz sterilisieren, sonst setzt sich Schimmel durch. Außerdem muss die Substratstruktur so grob sein, dass genügend Sauerstoff auch bis zum Boden des Gefäßes dringen kann. Sägespäne sind daher nachweislich ungeeignet.
Und man sollte die Aussaat zunächst auf Haferagar durchführen, damit man im Falle von Massenkeimung keine Massenbelegung erhält. Besser ist es, Protokorme gezielt auf das infizierte Holzsubstrat aufzulegen. Bei mir bleiben die Sämlinge dann bis zum Auspikieren auf dem Substrat, also ohne Umlegen!
Laubholz scheint besser geeignet als Nadelholz. Ich würde zunächst mit unterschiedlichen Konzentrationen des Düngemittels versuchen, einen optimalen Wert zu finden und mit dem dann verschiedene Arten ausprobieren und schließlich auch verschiedene Pilze.
Um Missverständnisse zu vermeiden, ich mache diese Versuche auch selbst, aber das Feld der Möglichkeiten ist so groß, dass ein Einzelner nur ein wenig herumstochern kann. Hier fänden angehende Biologen Themen für Diplomarbeiten und Dissertationen, letztere sogar Guttenberg-sicher. :whistle
Nun gut, was aber ist nun der A36? :-D :-D :-D
Diskussion über Holzsubstrate dort:
http://www.orchideenkultur.net/index.php?topic=3694.msg263208#msg263208
Zitat von: Claus am 26.Aug.12 um 12:45 Uhr
Vielleicht noch wissenswert, weil immer mal gefragt, der B1 wurde von Jim Hill aus der Wurzel einer Dactylorhiza fuchsii isoliert, was er 1997 im Heft der HOS auch beschrieben hatte: "Hill, J. (1997) Symbiotic culture of hardy orchid seedlings. The Hardy Orchid Society Newsletter 5: 14-16".
Hallo Claus,
hast Du mal versucht, aus den Wurzeln von Sämlingen die Auf B1 gewachsen sind, den Pilz in "aufgereinigter" Form erneut zu Isolieren? Die anderen Komponenten des "gemischten" B1 sollten nicht so tief in die Wurzel eindringen können.
Ich glaube, wir hatten darüber mal nachgedacht, auch ob man durch Auftrennung im anaeroben Teil des Agars in einem Reagenzglas so etwas zustande bringen könnte.
Zitat von: Timm Willem am 27.Aug.12 um 22:15 Uhr
Hallo Claus,
hast Du mal versucht, aus den Wurzeln von Sämlingen die Auf B1 gewachsen sind, den Pilz in "aufgereinigter" Form erneut zu Isolieren? Die anderen Komponenten des "gemischten" B1 sollten nicht so tief in die Wurzel eindringen können.
Es scheint so zu sein, das gewisse Mischpilzkuturen die Samen besser keimen als der reine B1. Deshalb scheint mir eine Pilzselektion durch die Übertragung gut geförderter Protokorme oder Sämlinge der beste Weg zum Erhalt guter Keimpilze zu sein.
Zitat von: Berthold am 27.Aug.12 um 22:23 Uhr
Zitat von: Timm Willem am 27.Aug.12 um 22:15 Uhr
Hallo Claus,
hast Du mal versucht, aus den Wurzeln von Sämlingen die Auf B1 gewachsen sind, den Pilz in "aufgereinigter" Form erneut zu Isolieren? Die anderen Komponenten des "gemischten" B1 sollten nicht so tief in die Wurzel eindringen können.
Es scheint so zu sein, das gewisse Mischpilzkuturen die Samen besser keimen als der reine B1. Deshalb scheint mir eine Pilzselektion durch die Übertragung gut geförderter Protokorme oder Sämlinge der beste Weg zum Erhalt guter Keimpilze zu sein.
Ja, das hatten wir auch schon mal ausdiskutiert. Es wäre aber auch interessant mal einen wirklich sauberen B1 vergleichen zu können, so bleibt immer ein Zweifel, ob es sich bei den verwendeten Keimpilzen nicht allgemein um Mischungen handelt, die eben durch die selektive Verwendung nicht sauberer aber funktionierender Kulturen entstanden sind.
Zitat von: Timm Willem am 27.Aug.12 um 22:15 Uhr
Hallo Claus,
hast Du mal versucht, aus den Wurzeln von Sämlingen die Auf B1 gewachsen sind, den Pilz in "aufgereinigter" Form erneut zu Isolieren? Die anderen Komponenten des "gemischten" B1 sollten nicht so tief in die Wurzel eindringen können.
Ich glaube, wir hatten darüber mal nachgedacht, auch ob man durch Auftrennung im anaeroben Teil des Agars in einem Reagenzglas so etwas zustande bringen könnte.
Nein, der Aufwand war mir immer zu hoch, und an die Mischung verschiedener Pilze im B1 glaube ich auch nicht.
Was wir mal diskutiert hatten ist die Abtrennung von Schimmelpilzen vom Nutzpilz in einem Reagenzglas mit Haferagar. Die Pilze sind unterschiedlich sauerstoffabhängig und können somit unterschiedlich tief in eine Haferagarschicht eindringen. Wenn man nun das Reagenzglas an der Grenzfläche zwischen eingedrungenem Pilz und dem unangegriffenen Agar aufschneidet könnte es sein, dass man den Nutzpilz in reiner Form erhält - vorausgesetzt er kann tiefer eindringen als der Schimmelpilz.
Hintergrund war der von der DSMZ gekauften Pilz, der mit Schimmel verunreinigt ausgeliefert wurde. Da die bei der DSMZ gespeicherten 3 Orchideenpilze ohnehin wenig aktiv und damit interessant sind, steht bei mir das Reagenzglas immer noch im Keller.
Bei der Isolierung von Orchideenpilzen aus Wurzeln erwischt man fast immer auch einen Schimmelpilz, von dem man sich dann nur schwer trennen kann.
Zitat von: Timm Willem am 27.Aug.12 um 22:48 Uhr
..., so bleibt immer ein Zweifel, ob es sich bei den verwendeten Keimpilzen nicht allgemein um Mischungen handelt, ...
Ich denke nicht das es sich um Mischungen unterschiedlicher Pilze beim B1 handelt.
Pilzkulturen wachsen nur in den seltensten Fällen ineinander. Normalerweise differenzieren sie sich und bilden eigene Hoheitsgebiete aus in denen sie keine anderen Pilze dulden.
Wenn das beim B1 der Fall wäre, sollten sich in unseren gläsern verschiedene Fläche bilden. Diesen effekt konnte ich bislang aber noch nicht erkennen.
Zitat von: Charlemann am 28.Aug.12 um 23:25 Uhr
Wenn das beim B1 der Fall wäre, sollten sich in unseren gläsern verschiedene Fläche bilden. Diesen Effekt konnte ich bislang aber noch nicht erkennen.
Michael, grundsätzlich ja, aber den Effekt gibt es sicher nicht bei allen Pilzmischungen. Der Schimmel z. B. mischt sich hervorrragend mit dem B1. Den bekommt man nie wieder raus.
Zitat von: Berthold am 29.Aug.12 um 01:14 Uhr
Zitat von: Charlemann am 28.Aug.12 um 23:25 Uhr
Wenn das beim B1 der Fall wäre, sollten sich in unseren gläsern verschiedene Fläche bilden. Diesen Effekt konnte ich bislang aber noch nicht erkennen.
Michael, grundsätzlich ja, aber den Effekt gibt es sicher nicht bei allen Pilzmischungen. Der Schimmel z. B. mischt sich hervorrragend mit dem B1. Den bekommt man nie wieder raus.
Der mischt sich nicht sondern verdrängt den B1. Falls es Mischungen sind, dann nur ein sehr enger genetischer Bandbreite, so wie ja auch immer wieder Mutationen auftreten. Die tolerieren dann einander. Das spielt aber für uns keine Rolle.
Seit ich die Pilzkulturen unter den gleichen Sterilbedingungen verarbeite wie die asymbiotischen Kulturen habe ich das Schimmelproblem auch nicht mehr.
Ich hatte ja mal spaßhalber versucht den B1 von Claus zu sequenzieren aber da ist nur Müll rausgekommen da es sich offensichtlich um eine Mischung verschiedener Arten handelte. Und Auftrennung durch Klonierung wäre zu aufwändig bzw. vom Verbrauchsmaterial auch zu teuer gewesen - sowas macht man nicht mal schnell nebenbei.
Morphologisch hat die Probe aber nach Ceratobasidium ausgesehen sagte unser Mycologe, eine Kontamination durch Ascomyceten (Schimmel) war nicht erkennbar. Trotzdem muss noch was anderes dringesteckt haben.
LG,
Christian
Zitat von: Claus am 29.Aug.12 um 11:26 Uhr
Der mischt sich nicht sondern verdrängt den B1.
ja, aber in dem Glas mit dem Schimmelzusatz sind die Protokorme
zunächst besser gefördert worden als von reinem B1. Später scheint der Schimmel dann neagtiv zu wirken.
Zitat von: Berthold am 30.Aug.12 um 23:21 Uhr
Zitat von: Claus am 29.Aug.12 um 11:26 Uhr
Der mischt sich nicht sondern verdrängt den B1.
ja, aber in dem Glas mit dem Schimmelzusatz sind die Protokorme zunächst besser gefördert worden als von reinem B1. Später scheint der Schimmel dann neagtiv zu wirken.
Folgende Hypothese dazu:
Laut Dr. Beyrle ist es ja so, dass zu hohe N-Levels u.U. eine symbiotische Beziehung zw. Orchideenembryo und Pilz verhindern können. Gerade Hafer ist ja definitiv das N-reichste Getreide (knapp 50mg/3g). Was, wenn nun der, durch den Schimmel verminderte N-Anteil dafür verantwortlich ist, dass hernach die symbiotischen Beziehungen besser funktionieren - zumindest so lange, bis der Schimmel beginnt mit dem an sich sehr bescheiden lebenden Symbiosepilz so zu konkurrieren, dass selbiger seiner Ernährerrolle für die Sämlinge nicht mehr hinreichend nachkommen kann?
Kommentare?
Das ist ja eine akademische Diskussion nach dem Motto: "Wieviel Engel passen auf eine Nadelspitze?". :-D :-D :-D Besser ist es doch, so sauber zu arbeiten, dass erst gar kein Schimmel auftritt.
Noch nie habe ich bei kontaminierten Gläsern eine Förderung der Sämlinge oder verbesserte Keimung festgestellt, allenfalls eine Art Tolerierung.
Wir sollten vielleicht einmal sammeln, um auch Berthold zu einer Sterilbank zu verhelfen. In seiner Küche ist aber kein Platz mehr :whistle :whistle :whistle
Zitat von: winwen am 31.Aug.12 um 08:23 Uhr
Zitat von: Berthold am 30.Aug.12 um 23:21 Uhr
Zitat von: Claus am 29.Aug.12 um 11:26 Uhr
Der mischt sich nicht sondern verdrängt den B1.
ja, aber in dem Glas mit dem Schimmelzusatz sind die Protokorme zunächst besser gefördert worden als von reinem B1. Später scheint der Schimmel dann neagtiv zu wirken.
Folgende Hypothese dazu:
Laut Dr. Beyrle ist es ja so, dass zu hohe N-Levels u.U. eine symbiotische Beziehung zw. Orchideenembryo und Pilz verhindern können. Gerade Hafer ist ja definitiv das N-reichste Getreide (knapp 50mg/3g). Was, wenn nun der, durch den Schimmel verminderte N-Anteil dafür verantwortlich ist, dass hernach die symbiotischen Beziehungen besser funktionieren - zumindest so lange, bis der Schimmel beginnt mit dem an sich sehr bescheiden lebenden Symbiosepilz so zu konkurrieren, dass selbiger seiner Ernährerrolle für die Sämlinge nicht mehr hinreichend nachkommen kann?
Kommentare?
Dann müssten die Samen auf sauberem B1 mit 1.5 g/l Haferflocken
zunächst besser keimen als mit 2.5 g/l. Das scheint aber nicht der Fall zu sein. Habe es aber persönlich nicht getestet.
Claus, ich propagiere in keiner Weise, mit Mischpilzkulturen zu arbeiten. Das ist viel zu unübersichtlich. Ich wollte nur sagen, dass das Schlechte auch manchmal etwas Gutes hat.
Zitat von: Berthold am 31.Aug.12 um 11:33 Uhr
Zitat von: winwen am 31.Aug.12 um 08:23 Uhr
Zitat von: Berthold am 30.Aug.12 um 23:21 Uhr
Zitat von: Claus am 29.Aug.12 um 11:26 Uhr
Der mischt sich nicht sondern verdrängt den B1.
ja, aber in dem Glas mit dem Schimmelzusatz sind die Protokorme zunächst besser gefördert worden als von reinem B1. Später scheint der Schimmel dann neagtiv zu wirken.
Folgende Hypothese dazu:
Laut Dr. Beyrle ist es ja so, dass zu hohe N-Levels u.U. eine symbiotische Beziehung zw. Orchideenembryo und Pilz verhindern können. Gerade Hafer ist ja definitiv das N-reichste Getreide (knapp 50mg/3g). Was, wenn nun der, durch den Schimmel verminderte N-Anteil dafür verantwortlich ist, dass hernach die symbiotischen Beziehungen besser funktionieren - zumindest so lange, bis der Schimmel beginnt mit dem an sich sehr bescheiden lebenden Symbiosepilz so zu konkurrieren, dass selbiger seiner Ernährerrolle für die Sämlinge nicht mehr hinreichend nachkommen kann?
Kommentare?
Dann müssten die Samen auf sauberem B1 mit 1.5 g/l Haferflocken zunächst besser keimen als mit 2.5 g/l. Das scheint aber nicht der Fall zu sein. Habe es aber persönlich nicht getestet.
...nicht unbedingt. Wenn der Schimmel zumindest Anfangs mehr Stickstoff als Kohlehydrate zehrt, verbessert er das C/N-Verhältnis, und dass 1,5g Hafer mit Zuckerzusatz tw. besser funktioniert als 2,5g Hafer, hat irgendwer hier im Forum schon gezeigt (allerdings nur mit Anacamptis morio glaub' ich).
Das war ich glaube ich, winwen. Aber ich habe zusätzlich noch 2gr. Zucker zugegeben.
Den Grund kannst Du hier lesen.
http://www.orchideenkultur.net/index.php?topic=326.msg67195#msg67195
Hier und da mache ich das heute auch noch so.