Impfen des Nährbodens

[Uhu]

Berthold, wenn du die Aussaatböden mit schönen Protokormen einer vorangegangenen Aussaat beimpfst selektierst du doch automatisch.

[Berthold]

Berthold, wenn du die Aussaatböden mit schönen Protokormen einer vorangegangenen Aussaat beimpfst selektierst du doch automatisch.

Ich nehme nie oder nur selten Impfsubstrat aus einem Glas, in das ich schon ausgesät habe, wegen der Gefahr der Verunreinigung.
Leider entwickelt sich die Pilzimpfung in fast jedem Glas etwas unterschiedlich. Wenn ich Pech habe, hat das Rückstellglas oder die Rückstellgläser, die ich später zur neuen Impfung benutze, eine schlechteren Pilz.

[neil]

3 Monate nach der Aussaat.
2 Monate nach der Aussaat umgelegt auf neuen vorinfizierten Haferflocken-Boden.
Jetzt sind die Sämlinge ca. 12 mm gross und treiben Wurzeln

Berthold, why are you inoculating the media before you transplat the protocorm onto it?  The protocorm has the fungi in/on it so will be transferred when you move it acroos to the new media.

[Berthold]

Neil, I prefer infection of media by a more defined fungus.

[neil]

Berthold, thanks.

[winwen]

Berthold, wenn du die Aussaatböden mit schönen Protokormen einer vorangegangenen Aussaat beimpfst selektierst du doch automatisch.

Ich nehme nie oder nur selten Impfsubstrat aus einem Glas, in das ich schon ausgesät habe, wegen der Gefahr der Verunreinigung.
Leider entwickelt sich die Pilzimpfung in fast jedem Glas etwas unterschiedlich. Wenn ich Pech habe, hat das Rückstellglas oder die Rückstellgläser, die ich später zur neuen Impfung benutze, eine schlechteren Pilz.

Die Methode, immer mit Protokormen von vorangegangenen Aussaaten den Pilz auf neue Aussaaten überzuimpfen, stellt grundsätzlich eine gute Methode der Selektion des Pilzes dar, da man ziemlich sicher sein kann, einen gut funktionierenden Pilz zu verwenden. Damit Verunreinigungen nicht mit rüberkommen, empfehle ich 15 minütige Desinfektion des Protokorms in 6%igem Peroxyd (wie z.B. die Reinigungsflüssigkeiten für Aquarien). Meist zahlt das Protokorm drauf, aber der Pilz in der Rinde des Protokorms überlebt es und wächst wenige Stunden nachdem das Protokorm auf den frischen Boden übersiedelt ist, gleich aus diesem heraus und besiedelt das neue Substrat.

[Claus]

Aber falls es ein unsauberer Pilz ist oder sonstwie kontaminiert ist, dann sterben die Sämlinge nach dem ersten Umlegen ab.

[winwen]

Aber falls es ein unsauberer Pilz ist oder sonstwie kontaminiert ist, dann sterben die Sämlinge nach dem ersten Umlegen ab.

Genau das habe ich aber beim Überimpfen mit in Peroxyd gewaschenen Protokormen noch nie beobachtet.
Was ich allerdings schon öfter beobachtet habe ist, dass ein Pilz aus Reinkultur nach der Beimpfung des Mediums  nicht angesprungen ist. Eben das ist mir mit der anderen Methode aber auch noch nie passiert.

[Uhu]

... Damit Verunreinigungen nicht mit rüberkommen, empfehle ich 15 minütige Desinfektion des Protokorms in 6%igem Peroxyd ...

lässt du die Protokorme darin einfach ein bisschen baden? Mich interessiert wie du dabei vorgehst. Steriles Gefäß, reinwerfen, schütteln?

[winwen]

... Damit Verunreinigungen nicht mit rüberkommen, empfehle ich 15 minütige Desinfektion des Protokorms in 6%igem Peroxyd ...

lässt du die Protokorme darin einfach ein bisschen baden? Mich interessiert wie du dabei vorgehst. Steriles Gefäß, reinwerfen, schütteln?

Geschüttelt, nicht gerührt (gebadet). 15 Minuten in stabilisierten 6%igem Peroxyd (Söchting Oxidatorlösung unverdünnt, gibt's beim ....bach). Danach mit sterilem Wasser nachspülen und wahlweise steril oder unsteril aufs neue Nähemedium aufbringen. Die verwendeten Protokormen sollten die Winterruhe noch nicht ganz hinter sich haben.
Das erwies sich bei mir als geeignete Möglichkeit, den Pilz wieder gut verwendbar hinzukriegen.
Mittlerweile keimt der B1 bei mir Dactylorhiza maculata (Samen gewaschen und nachgespült) wieder problemlos nach exakt 17 Tagen bei konstant 18-19°C.

[Berthold]

Erwin, I will give it a try, aber auf Deine Verantwortung.

[winwen]

Be brave, do it and be rewarded, Berthold!

[Berthold]

Mein aktueller A36 arbeitet zur Zeit ganz ordentlich.
Ich habe jedoch den Eindruck, dass sich Bakterien eingenistet haben, die das Orchideen-Wachstum nicht behindern, aber den Agar-Nährboden stellenweise an der Oberfläche verflüssigen.
Ich hoffe,  dass man mit der Winwen-Technik diese Bakterien abtöten kann.
We will see.

[winwen]

Das gleich als winwen-Technik zu bezeichnen ist zuviel der Ehre. Letztlich geht die Idee auf die Ausführungen von Frank zurück, der auf seiner Webseite eine (etwas komplexere) Prozedur zur Pilzisolation beschreibt.

Nachdem mir, als kategorischem Verfechter des Pilzreinheitsgebots, klar geworden ist, dass auch bei bestem sterilen Equipment ein Kontaminieren des Pilzes zuverlässig nicht auf immer und ewig verhindert werden kann, ebenso wie aufgrund von Mutationstendenzen zumindest von Zeit zu Zeit auch ein Selektieren des Pilzes aus erfolgreichen Kulturen nötig ist (was ebenfalls dem Reinheitsgebot zuwiderläuft), war der logische Schluss der, eine einfache Prozedur zusätzlich zum Selektieren einzuziehen, um Protokorme von geringfügigen Kontaminationen zu befreien, den Pilz aber zu erhalten.

Da lief mir dann Franks Seite über den Weg. Ich habe Verdünnungs- und Zeitreihen angesetzt und letztlich 15 Minuten bei 6%iger Konzentration H2O2 für adäquat befunden. Wichtig erscheint mir auch das Nachspülen. Das stellt zwar ein Risiko dar, sollte aber einfach zu machen sein, auch wenn man steril arbeiten will (einfach das Gläschen mit dem sterilen Wasser in der Bench öffnen, die desinifizierten Protokorme hineinkippen und nach einiger Zeit von dort auf das neue Medium transferieren).

Ich weiß nicht, ob der Pilz mit einem Durchgang gleich völlig sauber zu kriegen ist, ABER das ist -denke ich- auch nicht das Hauptziel. Es geht primär um eine Beschränkung der Kontaminationen auf ein Level, das den Pilz bei der Arbeit nicht stört und gleichzeitig die Möglichkeit einer fortgesetzten Selektion bietet. Die Natur schafft das ja auch unsteril.

Interessanter Weise überleben erstaunlich viele Protokorme sogar diese Prozedur. Sie werden außen wohl dunkel und nekrotisch, nach einiger Zeit jedoch "schlüpfen" aus dieser nekrotischen Hülle wieder neue, weiße Protokorme (ähnlich, wie Claus das schon mal bei zu spät umgelegten Protokormen beschrieben hat).

Wie auch immer: ich habe an dem ganzen Verfahren in letzter Zeit herumgetüftelt und bin letztlich zu dem Schluss gekommen, dass die Methode für mich gute Arbeit leistet - in Zukunft, so hoffe ich, auch für euch.

[Berthold]

Ich bin gespannt, ob die Protokorme überleben.
Es sind 1 cm grosse Protokorme mit grüner Spitze von Orchis morio alba (geselbstet) und von Dactylorhiza coccinea.
Die 6%-H2O2-Lösung ist ziemlich stark. Am Finger brennt sie heftig.
Der Nährboden enthält 4 g/l Haferflocken, ist also fetter als der übliche Aussaat Boden mit 3 g/l