B1 Sequenzierung

[fred]

Thanks Berthold,

if that's the case then there's little doubt that my culture contains 2 fungi and this is probably the Ceratobasidium sequenced by Michele. The question which remains in that case is: is it a contamination from me, or is this present in everybody's B1 ?

[Berthold]

is it a contamination from me, or is this present in everybody's B1 ?

Fred, my B1 is from the same source finally and I miss it in most of my flasks

[winwen]

Fred, my B1 is from the same source finally and I miss it in most of my flasks

....you miss it in most of your flasks, berthold, but not in all and since you wrote, that you are familiar with this kind of fungus, won't you find it highly unlikely that fred or michele contaminated their sample with the same fungus?
If your really miss it in most of your flasks, wouldn't that indicate that
1.) our B1 is a mixture and
2.) the germinating component is the usually stronger? (which would confirm what michele wrote about the behaviour of tulasnella and ceratobasidium in co-culture)
If this really is the case, an interesting question would be what made the contamination growing so strong? The medium?

[Berthold]

If your really miss it in most of your flasks, wouldn't that indicate that
1.) our B1 is a mixture and
2.) the germinating component is the usually stronger? (which would confirm what michele wrote about the behaviour of tulasnella and ceratobasidium in co-culture)
If this really is the case, an interesting question would be what made the contamination growing so strong? The medium?

if our B1 is a mixture I would have it in all my flasks but that's not the case (I "missed" it in most flasks).
I returned to the singl component oat flakes agar for better identification of contamination and I found this woolly fungus on oatflake agar. I think it's just a widespread fungus. 

[Berthold]

Example: Orchis longicornu on 2,5g/l oat flakes agar, 5 weeks old



straight B1:


contaminated B1:

Protocorm developement started in the same way as in straight B1 but after 4 weeks increase of the protocorms will be moderated

[Claus]

Erst nach dem Urlaub kam ich jetzt dazu, das Juli-Heft der HOS durchzublättern. Wir hatten ja den B1 als Tulasnella eingestuft.

Tony Heys hat jetzt einen Artikel verfasst mit dem Titel: "The B1 Fungus is a Ceratobasidium". Damit ist unsere Frage nach der Sequenzierung dieses Pilzes auch beantwortet. Vielleicht noch wissenswert, weil immer mal gefragt, der B1 wurde von Jim Hill aus der Wurzel einer Dactylorhiza fuchsii isoliert, was er 1997 im Heft der HOS auch beschrieben hatte: "Hill, J. (1997) Symbiotic culture of hardy orchid seedlings. The Hardy Orchid Society Newsletter 5: 14-16".

Tony beschreibt da auch, dass es von Ceratobasidium sexuelle Fruchtformen gibt. Die von Orchideen genutzten Pilze erscheinen an sich nur in der asexuellen (anamorphen) Form und nicht in der sexuellen (teleomorphen) Form. Die Teleomorphe könne man aber manchmal auf Holz als weißen oder grauen Bewuchs sehen.

Als Anregung vielleicht für junge Forscher, ich halte die Kultivierung von Orchideen-Sämlingen mit diesem oder einem anderen Pilz auf Holz-Substrat für eine sehr lohnende Aufgabe. Da Holz aber nur sehr wenig mineralische Stoffe enthält muss man diese in Form einer Imprägnierung zufügen, z.B. in Form handelsüblicher Dünger. Natürlich muss man das Substrat auch vor der Infektion mit dem Pilz sterilisieren, sonst setzt sich Schimmel durch. Außerdem muss die Substratstruktur so grob sein, dass genügend Sauerstoff auch bis zum Boden des Gefäßes dringen kann. Sägespäne sind daher nachweislich ungeeignet.

Und man sollte die Aussaat zunächst auf Haferagar durchführen, damit man im Falle von Massenkeimung keine Massenbelegung erhält. Besser ist es, Protokorme gezielt auf das infizierte Holzsubstrat aufzulegen. Bei mir bleiben die Sämlinge dann bis zum Auspikieren auf dem Substrat, also ohne Umlegen!

Laubholz scheint besser geeignet als Nadelholz. Ich würde zunächst mit unterschiedlichen Konzentrationen des Düngemittels versuchen, einen optimalen Wert zu finden und mit dem dann verschiedene Arten ausprobieren und schließlich auch verschiedene Pilze.

Um Missverständnisse zu vermeiden, ich mache diese Versuche auch selbst, aber das Feld der Möglichkeiten ist so groß, dass ein Einzelner nur ein wenig herumstochern kann. Hier fänden angehende Biologen Themen für Diplomarbeiten und Dissertationen, letztere sogar Guttenberg-sicher. 

Nun gut, was aber ist nun der A36? 

[Berthold]

Diskussion über Holzsubstrate dort:
http://www.orchideenkultur.net/index.php?topic=3694.msg263208#msg263208

[Timm Willem]

Vielleicht noch wissenswert, weil immer mal gefragt, der B1 wurde von Jim Hill aus der Wurzel einer Dactylorhiza fuchsii isoliert, was er 1997 im Heft der HOS auch beschrieben hatte: "Hill, J. (1997) Symbiotic culture of hardy orchid seedlings. The Hardy Orchid Society Newsletter 5: 14-16".

Hallo Claus,
hast Du mal versucht, aus den Wurzeln von Sämlingen die Auf B1 gewachsen sind, den Pilz in "aufgereinigter" Form erneut zu Isolieren? Die anderen Komponenten des "gemischten" B1 sollten nicht so tief in die Wurzel eindringen können.
Ich glaube, wir hatten darüber mal nachgedacht, auch ob man durch Auftrennung im anaeroben Teil des Agars in einem Reagenzglas so etwas zustande bringen könnte.

[Berthold]

Hallo Claus,
hast Du mal versucht, aus den Wurzeln von Sämlingen die Auf B1 gewachsen sind, den Pilz in "aufgereinigter" Form erneut zu Isolieren? Die anderen Komponenten des "gemischten" B1 sollten nicht so tief in die Wurzel eindringen können.

Es scheint so zu sein, das gewisse Mischpilzkuturen die Samen besser keimen als der reine B1. Deshalb scheint mir eine Pilzselektion durch die Übertragung gut geförderter Protokorme oder Sämlinge der beste Weg zum Erhalt guter Keimpilze zu sein.

[Timm Willem]

Hallo Claus,
hast Du mal versucht, aus den Wurzeln von Sämlingen die Auf B1 gewachsen sind, den Pilz in "aufgereinigter" Form erneut zu Isolieren? Die anderen Komponenten des "gemischten" B1 sollten nicht so tief in die Wurzel eindringen können.

Es scheint so zu sein, das gewisse Mischpilzkuturen die Samen besser keimen als der reine B1. Deshalb scheint mir eine Pilzselektion durch die Übertragung gut geförderter Protokorme oder Sämlinge der beste Weg zum Erhalt guter Keimpilze zu sein.

Ja, das hatten wir auch schon mal ausdiskutiert. Es wäre aber auch interessant mal einen wirklich sauberen B1 vergleichen zu können, so bleibt immer ein Zweifel, ob es sich bei den verwendeten Keimpilzen nicht allgemein um Mischungen handelt, die eben durch die selektive Verwendung nicht sauberer aber funktionierender Kulturen entstanden sind.

[Claus]

Hallo Claus,
hast Du mal versucht, aus den Wurzeln von Sämlingen die Auf B1 gewachsen sind, den Pilz in "aufgereinigter" Form erneut zu Isolieren? Die anderen Komponenten des "gemischten" B1 sollten nicht so tief in die Wurzel eindringen können.
Ich glaube, wir hatten darüber mal nachgedacht, auch ob man durch Auftrennung im anaeroben Teil des Agars in einem Reagenzglas so etwas zustande bringen könnte.

Nein, der Aufwand war mir immer zu hoch, und an die Mischung verschiedener Pilze im B1 glaube ich auch nicht.

Was wir mal diskutiert hatten ist die Abtrennung von Schimmelpilzen vom Nutzpilz in einem Reagenzglas mit Haferagar. Die Pilze sind unterschiedlich sauerstoffabhängig und können somit unterschiedlich tief in eine Haferagarschicht eindringen. Wenn man nun das Reagenzglas an der Grenzfläche zwischen eingedrungenem Pilz und dem unangegriffenen Agar aufschneidet könnte es sein, dass man den Nutzpilz in reiner Form erhält - vorausgesetzt er kann tiefer eindringen als der Schimmelpilz.

Hintergrund war der von der DSMZ gekauften Pilz, der mit Schimmel verunreinigt ausgeliefert wurde. Da die bei der DSMZ gespeicherten 3 Orchideenpilze ohnehin wenig aktiv und damit interessant sind, steht bei mir das Reagenzglas immer noch im Keller.

Bei der Isolierung von Orchideenpilzen aus Wurzeln erwischt man fast immer auch einen Schimmelpilz, von dem man sich dann nur schwer trennen kann.   

[Charlemann]

..., so bleibt immer ein Zweifel, ob es sich bei den verwendeten Keimpilzen nicht allgemein um Mischungen handelt, ...

Ich denke nicht das es sich um Mischungen unterschiedlicher Pilze beim B1 handelt.
Pilzkulturen wachsen nur in den seltensten Fällen ineinander. Normalerweise differenzieren sie sich und bilden eigene Hoheitsgebiete aus in denen sie keine anderen Pilze dulden.
Wenn das beim B1 der Fall wäre, sollten sich in unseren gläsern verschiedene Fläche bilden. Diesen effekt konnte ich bislang aber noch nicht erkennen.

[Berthold]

Wenn das beim B1 der Fall wäre, sollten sich in unseren gläsern verschiedene Fläche bilden. Diesen Effekt konnte ich bislang aber noch nicht erkennen.

Michael, grundsätzlich ja, aber den Effekt gibt es sicher nicht bei allen Pilzmischungen. Der Schimmel z. B. mischt sich hervorrragend mit dem B1. Den bekommt man nie wieder raus.

[Claus]

Wenn das beim B1 der Fall wäre, sollten sich in unseren gläsern verschiedene Fläche bilden. Diesen Effekt konnte ich bislang aber noch nicht erkennen.

Michael, grundsätzlich ja, aber den Effekt gibt es sicher nicht bei allen Pilzmischungen. Der Schimmel z. B. mischt sich hervorrragend mit dem B1. Den bekommt man nie wieder raus.

Der mischt sich nicht sondern verdrängt den B1. Falls es Mischungen sind, dann nur ein sehr enger genetischer Bandbreite, so wie ja auch immer wieder Mutationen auftreten. Die tolerieren dann einander. Das spielt aber für uns keine Rolle.

Seit ich die Pilzkulturen unter den gleichen Sterilbedingungen verarbeite wie die asymbiotischen Kulturen habe ich das Schimmelproblem auch nicht mehr.

[Ahriman]

Ich hatte ja mal spaßhalber versucht den B1 von Claus zu sequenzieren aber da ist nur Müll rausgekommen da es sich offensichtlich um eine Mischung verschiedener Arten handelte. Und Auftrennung durch Klonierung wäre zu aufwändig bzw. vom Verbrauchsmaterial auch zu teuer gewesen - sowas macht man nicht mal schnell nebenbei.
Morphologisch hat die Probe aber nach Ceratobasidium ausgesehen sagte unser Mycologe, eine Kontamination durch Ascomyceten (Schimmel) war nicht erkennbar. Trotzdem muss noch was anderes dringesteckt haben.

LG,
Christian