B1 Sequenzierung

Begonnen von Ahriman, 25.Feb.09 um 21:20 Uhr

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Ahriman

Hallo!

Nach Rücksprache mit der Uni hab ich nun das OK für die Sequenzierung von B1 bekommen! :thumb

Das heißt ich brauche von euch mal ein Glas das möglichst dicht mit dem Pilz besiedelt und nicht kontaminiert ist, am besten zur Sicherheit gleich 2-3.
Und von dem ihr euch sicher seid dass es jener B1 ist!

Interessant wäre natürlich wenn sich zurückverfolgen ließe woher das Isolat nun wirklich stammt, ich habe nur den Hinweis B1 was isolated from a Dactylorhiza fuchsii in middle England by someone in the Hardy Orchid Society. gefunden.

LG,
Christian

Claus

Hallo Christian,

was heißt "möglichst dicht besiedelt"? Am dichtesten bekommst du den B1, wenn du die Haferflockenkonzentration z.B. auf 15 g/l bringst, dann würde er zwar parasitieren, aber da er nichts zum parasitieren hat, bildet er lediglich ein dichtes Fasergewirr von Hyphen. Bei der DSMZ wird auf Haferagar mit 30 g/l vermehrt.

Ich hätte ihn zur Zeit auf dem üblichen Haferagar, auf dem sicherheitshalber Protokorme von D. maculata sehr gut wachsen, könnte dir aber auch ein Präparat wie oben geschildert herstellen.

Welche Menge brauchst du?

Viele Grüße
Claus
Wer Chemiker werden will, muss Chemie studieren; wer Jurist oder Arzt werden will, muss Jura oder Medizin studieren. Aber um Politiker zu werden, ist lediglich das Studium der eigenen Interessen notwendig. (Max O'Rell)

Ahriman

Hallo Claus!

Naja, für die Sequenzierung wird nur eine winzige Menge Substanz (Nadelspitze) benötigt. Ist ein Glas nur teilweise oder allzu dünn besiedelt wirds natürlich schwer da gezielt was rauszufischen sodass sich der Pilz auch sicher im Sample befindet - und ein aufreinigen möchte ich mir sparen...

Wenn man die Hyphen deutlich erkennen kann sollte es passen. Ich habe ja noch nie mit B1 gearbeitet und weiß nicht wie dicht er normalerweise in den Gläsern wächst.

Auch wären zumindest 2 Gläser (können ruhig klein sein) nicht schlecht falls beim 1. Mal was nicht klappt hab ich noch eine 2. sterile Probe.

Ich schick dir noch ne PM...

LG,
Christian


Claus

#3
Hallo Christian,

der B1 bildet ja sog. Langhyphen, d.h. die Hyphen laufen im Normalfall immer in der Oberfläche des Nährbodens und dringen dann später allmählich in den Nährboden ein. Da sieht man sie natürlich nicht, aber man kann das Eindringen an einer Veränderung des Brechungsindex des Nährbodens erkennen. Sie laufen auch ein Stück an der Glaswand empor, weil dort vom Sterilisieren her auch noch geringe Mengen Haferagar kleben. Auf der Oberfläche des Agars befindet sich auch immer eine gewisse "Suppenschicht".

Man kann also die Hyphen nicht einfach als Reinsubstanz fassen, sondern man erhält immer etwas vom Haferagar mit. Macht das was?

Sonst würde ich doch erst einmal den Pilz mit hohem Gehalt an Hafer anzüchten; denn dann bilden sich auch Lufthyphen, die man als Reinsubstanz erfassen kann. Das dauert aber etwas.

Ich könnte auch beides liefern.

Ergänzung: Auf alten Kulturen des B1 befinden sich immer Konidien als gelbliche Knubbel. Die könnten natürlich weniger vom Hafer enthalten. Hätte ich auch da.

Viele Grüße
Claus
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Ahriman

Hallo Claus!

Nein, solange es nur der Haferflockenagar ist macht es gar nichts wenn er mit in der Probe ist, da sollte nichts inhibierendes drinnen sein.
Interessant wären aber die angesprochenen Konidien, da ließe sich auch morphologisch was machen. Bitte schick mir auf jeden Fall ein Glas davon.
Ansonsten - wiegesagt, es geht nur darum dass man die Hyphen findet und nicht ne Probe sequenziert wo gar kein Pilz drinnen ist.

Bin schon gespannt was da rauskommt...

LG,
Christian

Timm Willem

Hallo Christian,

ich finde das wirklich spannend. Wenn man eine Sequenzierung macht, bekommt man doch eine Reihenfolge für die Basenpaare je nach Laufrichtung(ATGCGT...Blabla). Dann kann man doch die Sequenz mit den ganzen in der Welt vorhandenen Sequenzierdaten vergleichen und hat dann sehr schnell den genauen Namen der Art, eventuell sogar die genaue Herkunft??? Sind den wirklich schon alle Pilzarten sequenziert, oder besteht die Gefahr, dass es ein ganz neuer Pilz ist?
Wie lange dauert es dann die gefundene Sequenz mit anderen zu vergleichen? Kann man die Daten aus dem Netz bekommen?

Viele Grüße
Timm

Charlemann

Zitat von: Timm Willem am 28.Feb.09 um 20:27 Uhr
Sind den wirklich schon alle Pilzarten sequenziert, oder besteht die Gefahr, dass es ein ganz neuer Pilz ist?

Ich nehme mal an das es eine neue Art ist.
Inwieweit sämtliche Pilze auf unserem Globus Sequenziert wurde ist mir nicht geläufig, aber ich glaube wohl kaum das es schon mehr als 1% sind.

Timm Willem

Hallo Michael,

ich vermute, dass es bei dieser Frage um die Zuordnungskriterien geht. Wahrscheinlich ist es ein noch nicht beschriebener Klon(es gibt auch anders lautende Gerüchte). Das schließt aber nicht aus, dass man B1 durch die Erkenntnisse aus der Sequenzierung sehr nah zu einer bekannten Art oder Gruppe zuordnen kann. Möglicherweise ist die Enttäuschung dann groß, wenn die nächsten Verwandten als Orchideenkeimer nicht so erfolgreich sind wie B1, was ja denkbar ist, da B1 bis jetzt sehr erfolgreich war(ein echter evolutionärer Vorteil, solange er die Orchideen gut keimt, halten wir seine ökologische Nische in unseren Gläsern offen).
Was ist denn der nächste Schritt, wenn man die Sequenz von B1 herausgefunden hat? Wo kann man das dann abgleichen?

Viele Grüße
Timm

Berthold

Zitat von: Timm Willem am 01.Mär.09 um 00:27 Uhr
Möglicherweise ist die Enttäuschung dann groß, wenn die nächsten Verwandten als Orchideenkeimer nicht so erfolgreich sind wie B1, was ja denkbar ist, da B1 bis jetzt sehr erfolgreich war(ein echter evolutionärer Vorteil, solange er die Orchideen gut keimt, halten wir seine ökologische Nische in unseren Gläsern offen).
Viele Grüße
Timm


Nach meinen Erfahrungen gibt es auch bei dem B1 Pilzindividuen, die 10% des Samens im Glas, andere 1% und wieder andere nur 0.1% keimen können. Ich weiss leider auch nicht wie stabil der Pilz genetisch ist und ob er schon nach 5 maliger Neuanzucht (also etwa 1 Jahr) vom "Top-Keimer" zum "Nichtkeimer" mutieren kann.

Es gibt eine Arbeit (hat Phil hier eingestellt, finde sie aber auf die Schnelle nicht), in der wurde u. a. die Keimfähigkeit eines Pilzes an australischen Erdorchideen untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass Pilze der selben Art aber von unterschiedlichen Herkunftsorten sehr unterschiedliche Keimfähigkeit besaassen.
Weniger gelobt ist genug kritisiert (frei nach Peter Altmaier)

Ahriman

Ich hatte ja schonmal versprochen was zu Ablauf und Ergebnis einer Sequenzierung zu schreiben, also hier mal um die meisten Fragen zu klären...

Wir nehmen eine winzige Probe die den Pilz enthält und sequenzieren sie mittels Didesoxymethode nach Sanger.
Dazu werden Primer für ITS1 also die nicht für Gene codierende DNA Region zwischen den Genen für 2 rRNAs eingesetzt. Da der DNA-Abschnitt keine Funktion erfüllt und Mutationen dort folgenlos bleiben verändert er sich entsprechend rasch und kann auch zur Unterscheidung sehr nah verwandter Organismen oder sogar Subspezies eingesetzt werden.

Heraus kommt ein Chromatogramm welches sich in eine Basenabfolge umrechnen lässt.

Im Falle eines aus den hohlen Bulben von Caularthron bilamellatum isolierten Pilzes sieht das so aus: Caularthron_endophyte1.txt

Die Sequenz kann man nun mit verschiedenen Datenbanken vergleichen, eine der größten ist die  Nucleotide collection des NCBI welche man online mit dem Tool BLAST durchsuchen kann.
Probiert es aus, einfach den Inhalt des Textdokuments in das Enter Search Query Fenster der Seite kopieren, als Datenbank Nucleotide Collection auswählen, als Program Selection Somewhat similar sequences wählen und auf BLAST klicken.
Wie man sieht bekommt man eine Fülle von Ergebnissen mit dem jeweiligen Alignment zwischen der eigenen und einer Datenbank-Sequenz.

Der Teufel steckt wie immer im Detail, wie aussagekräftig das was rauskommt ist hängt erheblich von den Parametern ab welche man dem Programm vorgibt (bei Programmen zur Stammbaumerstellung noch wesentlich komplexer).
Aber schon bei dieser simpelsten Demonstration kann man den Pilz in die Verwandtschaft um Clavariadelphus einordnen.

Man sieht aber dass es keine Sequenzen gibt die ident mit dem Pilz sind, das ist bei einer Umweltprobe aus den Tropen aber auch nicht zu erwarten. Zu B1 wird man mehr ähnliche Sequenzen finden denke ich mal.

Man darf aber auf keinen Fall annehmen dass so eine willkürlich gewählte genetische Identität etwas über die Funktion des Organismus aussagt. Wie ihr schon erwähnt habt mutieren Pilze (wenn auch nicht so extrem wie Bakterien) relativ rasch und können verschiedenste ökologische Nischen besetzen und Stoffwechselwege betreiben obwohl sie die selbe "Art" sind. Auch verlieren sie nicht benötigte Gene wenn man sie zu lange auf einem Vollmedium kultiviert. Dementsprechend wäre mit Sicherheit auch ein B1 Stamm den man längere Zeit "asymbiotisch" kultiviert nicht mehr zur Keimung von Samen zu gebrauchen.

Naja, ich bin schon gespannt was rauskommt, ideal wäre natürlich falls auch eine morphologische Zuordnung von B1 möglich wäre.


LG,
Christian

fred

Sorry for posting in English ... I read & speak German but writing is a problem.

Hi Christian,

I'm interested to read about your results. I sent a culture of the B1 to the University of Torino, Italy for identification (last year). I just mailed them and hopefully I'll have an answer by the end of the week.

kind regards,
Fred (the one from terrorchid.org)

Berthold

Hello Fred,
nice to meet You here. We are also interested here in Your Mykorrhiza-Germination experiment.
Greetings Berthold
Weniger gelobt ist genug kritisiert (frei nach Peter Altmaier)

winwen

Hi everybody!

Are there any news on the identity of our famous B1-strain?
Gibt's was neues zur Identität unseres so heißgeliebten B1?

Erwin

Ahriman

Hallo!

In Wien nichts neues, so far...

Es gibt momentan einen ziemlichen Probenrückstau sodass es noch 1-2 Wochen dauern könnte bis der Pilz sequenziert ist.

Rafael hat in Ingrids Forum gepostet dass er einige Pilze - darunter B1 - sequenziert hat, leider hat er auf meine PN nicht geantwortet.

LG,
Christian

Charlemann

Zitat von: Ahriman am 02.Apr.09 um 01:46 Uhr
Rafael hat in Ingrids Forum gepostet dass er einige Pilze - darunter B1 - sequenziert hat, leider hat er auf meine PN nicht geantwortet.

Jaja, das wollte er schon lange mal gemacht haben.
Aber irgendwie ist das dann im Sande verlaufen.