Aussaat von Cyp arietinum

[Claus]

@Timm: Na ja, man muss sich natürlich an die Feinheiten heran tasten. Ich halte mich da normalerweise an die Ratschläge erfahrener Fachleute, z.B. Bill Steele. Übrigens sind dazu ja bei weitem nicht alle bereit. Das ist doch heute noch mehr oder weniger eine Fülle "privater Mitteilungen".

Wir beide haben ja nun auch die Nachteile dieser Hormonspritzen in Umlegeböden gesehen, z.B. massive PLB-Bildung statt zügigem Wachstum. Bill hat Erfahrungen bei Versuchen gesammelt, bei denen er in der Spitze auch mit mehr als 1 ppm arbeitete. Er sagt heute, mehr als 0,5 ppm führen zu schlechter Differenzierung der Protokorme, und genau das habe ich auch erlebt, vor allem bei den Versuchen mit BAP. Er setzt heute 0,3 ppm ein, das reicht offenbar zur Keimung aus.

Meine jetzigen Keimungen von Cypripedien sind ja noch auf Basis von 0,5 und 1 ppm Kinetin entstanden. Da muss ich nun nach dem Umlegen auf hormonfreien Boden sehen, was passiert. Auf jeden Fall soll man nach Bill in Umlegeböden keine Hormone mehr einbringen, allerdings wird man das mit den Kartoffelstückchen natürlich in gewissem Maße dennoch tun.

Mir fiel beim Umlegen der Protokorme von Cyp. macranthos auf, dass sich in den meisten Reagenzgläsern massiv Phenole gebildet hatten. Das war vor ca. einer Woche, als ich die Gläser aus den dunklen Kästen nahm, noch nicht in diesem Maße der Fall. Ich hatte die umlegefähigen Gläser aussortiert, und sie standen diese Zeit auf einer "schattigen" Stelle auf meinem Schreibtisch, natürlich nicht völlig dunkel. Ein Teil der Protokorme war gestern bereits abgestorben. Das kann natürlich auch der Zeitfaktor sein. Der Nährboden enthielt keine A-Kohle.

@Berthold: Ich kann mir auch kaum vorstellen, dass die kurzzeitige Belichtung etwas ausmacht. Vor allem kann man ja die Protokorme nicht im Dunkeln umlegen.  Bill meinte aber, man solle im Fall des C. arietinum die Gläser erst nach 4 Monaten anschauen. Da kann man nur hoffen, dass man dann nicht nur Schimmel zu sehen bekommt.  Ich halte mich im Übrigen auch nicht daran, dazu bin ich viel zu neugierig. 

Wir kennen aber auch die Berichte von "vergessenen" Gläsern, in denen nach langer Zeit dann doch noch starke Keimung eintrat. Bei manchen Arten wird behauptet, dass sie nur keimen, wenn sie ununterbrochen eine Zeitlang völlig dunkel stehen. Wenn man sie also jede Woche einmal anschaut kommen sie nicht zur Keimung. Hanne Rasmussen schreibt noch zu dem Thema, dass es da noch keine aussagefähigen Forschungen gibt. Das wäre doch ein Thema für den Nachwuchs. Tobias, du bist gefordert!   

[Tobias]

Wir kennen aber auch die Berichte von "vergessenen" Gläsern, in denen nach langer Zeit dann doch noch starke Keimung eintrat. Bei manchen Arten wird behauptet, dass sie nur keimen, wenn sie ununterbrochen eine Zeitlang völlig dunkel stehen. Wenn man sie also jede Woche einmal anschaut kommen sie nicht zur Keimung. Hanne Rasmussen schreibt noch zu dem Thema, dass es da noch keine aussagefähigen Forschungen gibt. Das wäre doch ein Thema für den Nachwuchs. Tobias, du bist gefordert!   

Ich kann gerne Tests durchführen, kein Problem!Ein paar Samen habe ich noch hier .Viel ist aber auch schon "verbraucht".Da musste man eventuell etwas Forschungsmaterial besorgen.Ich werde in den Sommerferien dann mal ein paar Aussaaten machen.Ich werde dann folgende Gruppen aufmachen:
1.)Tägliches angucken unter Tageslicht
2.)Einmal die Woche
3.)Einmal im Monat
4.)Ein Monat dunkel
5.)Zwei Monate dunkel
6.)Drei Monate dunkel
7.)Vier Monate dunkel

Eventuell mehr.Gruppe eins bis drei um zu klären, ob die Lichtmenge eintscheidend ist und die restlichen um zu klären, ob man Aussaaten generell dunkel halten sollte und wenn, wie lange.

Eventuell hat jemand Ergänzungen?

Mir ist das übrigens bei Traunsteinera globosa passiert.Ein Reagenzglas lag drei Monate vergessen im Dunkeln.Hier ist eine Keimung aufgetreten, bei den öfters durchgeschauten nicht.

lg Tobias

[Charlemann]

Evtl noch Gläser ganz hell stehend ohne Abdunkelung.

[Tobias]

Stimmt Michael, das sollte man auch testen.

[Volzotan]

Ich muss gestehen das ich erst heute ausgesät habe.
Wie Claus habe ich 60 min mit 0,5% NaOCl gebleicht.
Dann war ein Teil der Samen hell, ein teil an den Polkappen aufgehellt und ein Teil nach wie vor dunkel.
Die Becher sind jetzt in einem Karton zugeklebt im dunklen Schrank gelagert.
Hier vorher-nachher-Bilder:

Gruß Roman

[Berthold]

Dann war ein Teil der Samen hell, ein teil an den Polkappen aufgehellt und ein Teil nach wie vor dunkel.
Gruß Roman

Roman, ich denke, das ist eine kluge Bleichzeit.

[Volzotan]

Ach ja, es wurde natürlich mit sterilem Wasser nachgespült, das sollte man noch dazusagen.

Gruß Roman

[Stick †]

Ich muss gestehen das ich erst heute ausgesät habe.
Wie Claus habe ich 60 min mit 0,5% NaOCl gebleicht.
Dann war ein Teil der Samen hell, ein teil an den Polkappen aufgehellt und ein Teil nach wie vor dunkel.
Die Becher sind jetzt in einem Karton zugeklebt im dunklen Schrank gelagert.
Hier vorher-nachher-Bilder:

Gruß Roman

Vergiss meine Frage im acaule alba Eintrag, ich habe erst jetzt diesen Eintrag von Dir gelesen.

VG!
Gerhard

[Claus]

Diese ersten Aussaatrunden sind ja bekanntlich ein Schuss in den Ofen gewesen. Das ein einzige, schon gut aussehende Protokorm ging dann nach dem Umlegen von mir, schuld war eine einzige mit umgelegte Spore! Mist!

Ich habe mich inzwischen intensiv mit Bill Steele ausgetauscht. Und da ich vor längerer Zeit bei ebay eine Wasserstrahlpumpe gekauft hatte, der Exsikkator aus Studienzeiten immer noch nicht zerdeppert war, ich endlich auch wieder den Glashahn finden konnte und schließlich ein findiger junger Mann bei unserem Installateur den richtigen Adapter zwischen Pumpe und Wasserhahn fand, stand einer Aussaat à la Bill Steele nichts mehr im Weg.

Zunächst habe ich einen "Trockenlauf" mit Cyp. candidum und D. maculata gemacht. Die offenen Bleichröhrchen wurden mit einer Spatelspitze Samen und 3 ml dest. Wasser gefüllt, von dem 50 ml mit 3 Tropfen Spülmittel versetzt waren. Dann wurden die Röhrchen stabil im Exsikkator befestigt und die Luft abgepumpt. Es dauert aber mindestens 24 h, und man muss mehrmals öffnen und erneut absaugen, um die an den Wänden hängenden Samen wieder ins Wasser zu bringen, ehe sie zum Boden absinken.

Wenn man das mit Spülmittel versetzte Wasser nur absaugt aber nicht ersetzt, dann schäumt der Inhalt beim Bleichen zu stark. Also 2 x absaugen und wieder auffüllen. Dabei besteht das Problem, dass die Samen dann doch relativ stark dispergieren und schlecht absinken. Bei größeren Samen wie Dactylorhiza und auch vielen Cypripedien nimmt man dann eine blaue Nadel zum Absaugen, deren Öffnung ist so klein, dass man damit kaum Samen aufsaugen kann. Allerdings sind die Samen von Cyp. arietinum sehr winzig, die flutschen auch durch die blaue Nadel durch.

Also, ich habe D. maculata und Cyp. candidum letztlich doch auf den Nährboden bringen können.

Zum Glück sinken die Samen von Cyp. arietinum so ab, wie Bill das in seiner Veröffentlichung beschreibt, und sie dispergieren auch nicht, wenn man sie vor und nach der Bleiche wäscht.

Heute habe ich also Cyp. arietinum ausgesät. Aber bei der Bleiche stellt sich nicht das von Bill beschriebene äquatoriale braune Band ein, sondern die Embryonen werden hell, und nur an einem Pol verbleibt eine dunkelbraun gefärbte Schicht. Woran das nun wieder liegt? Jedenfalls soll ich die Gläser jetzt 3 Monate nicht betrachten, d.h. sie müssen vollständig dunkel bleiben. Hoffentlich gibt es keine Überraschung, und alle sind dann verschimmelt!

Ich habe ein paar Mikroaufnahmen gemacht, am besten scheint mir diese ,,Polfärbung" noch im Stereomikroskop sichtbar zu sein (letztes Foto).

[Berthold]

Heute habe ich also Cyp. arietinum ausgesät. Aber bei der Bleiche stellt sich nicht das von Bill beschriebene äquatoriale braune Band ein, sondern die Embryonen werden hell, und nur an einem Pol verbleibt eine dunkelbraun gefärbte Schicht. Woran das nun wieder liegt?

Die braune Kappe zeigt zum geschlossenen Ende der Testa hin. Vielleicht ist die Bleichflüssigkeit nicht gut in den hinteren Testa-Teil gelangt, weil er durch die Vakuum-Manipulation schon mit Wasser gefüllt war.
Du hättest die Testa am geschlossenen Ende mit einer Mikroschere aufschneiden müssen, dann wäre jetzt alles in Ordnung.

Aber Du kannst doch auch in einem Mörser die Samen vorsichtig mörsern. Dann brechen die Testa auseinander und die nackten Embryonen kullern raus. Dann kann man ohne Vakuum-System die Embryonen bestens bleichen. Das geht sehr gut mit Dactylorhiza-Samen. Mit anderen habe ich es nicht ausprobiert.

Ich denke aber, man kann die Vakuum-Vorbehandlung durch längere Bleichzeiten vollständig ersetzen.

Jedenfalls soll ich die Gläser jetzt 3 Monate nicht betrachten, d.h. sie müssen vollständig dunkel bleiben. Hoffentlich gibt es keine Überraschung, und alle sind dann verschimmelt!

Du kannst sie aber bestimmt mit Infrarot bestrahlen und über eine Wärmebildkamera betrachten.

Aber im Ernst, ich halte eine Schädigung durch wöchentliches kurzes Betrachten unter sichtbarem Licht für ausgeschlossen. Ich glaube, da will uns jemand auf den Arm nehemen oder er ist abergläubisch.

Vermutlich ist es bei arietinum ähnlich wie mit montanum Samen. Grün keimt er bestens, reif kaum, egal wie oft man sich ihn ansieht. 

[Claus]

Das mit den dunklen Kappen könnte die von dir beschriebene Ursache haben. Es trat nach 30 min auf, normal laut Bill sind mindestens eine Stunde, oft 2 1/2 h erforderlich. Bei den bisherigen Versuchen ohne Vakuumbehandlung waren die Samen allerdings sehr unterschiedlich gebleicht, von daher scheint mir die Methode eine Vergleichmäßigung gebracht zu haben.

Wenn ich jetzt länger gebleicht hätte, wäre vermutlich der dunkle Rand auch noch verschwunden. Aber dass dann noch ein braunes Band entstünde glaube ich nicht. Die ersten 3 Fotos zeigen nicht die wirkliche Helligkeit der Embryos, die sind bis auf den Südpol schon ziemlich bleich.

Nun war das erst die eine Hälfte der Samen, die ich immerhin in 6 Gläser ausgesät habe, mit zwei Nährbodenvarianten.

Ich habe noch die andere Hälfte und eine Ladung ist noch unterwegs. Zunächst schicke ich Bill mal die Fotos, da wird er den vielen Schnee rund ums Haus erst einmal vergessen.

[Claus]

Nun habe ich doch schon heute nachgeschaut, an sich sollten die Gläser ja bis morgen dunkel bleiben. Die Samen waren ja wie von Bill Steele beschrieben nach Vakuumvorbehandlung und sehr langer Bleiche 3 Monate völlig dunkel gehalten worden. Allerdings konnte ich nur 45 min bleichen, während Bill bis zu 2,5 h angab. Spätere Aussaten musste er aber auch deutlich kürzer bleichen.

Ich erinnere noch mal: Die äquatorialen braunen Streifen entstanden bei meiner Bleiche nicht, dafür auf der Innenseite der Testa braune Reste. Ich vermute, dies liegt an zu langer Vakuumbehandlung, die aber notwendig war, um die Samen zum Sinken zu bringen.

Inzwischen hat Bill an anderer Stelle bei anderen Arten geschrieben, dass er die Vakuumbehandlung mehrfach unterbricht und die Samen dann wieder mechanisch in das Wasser bringt. Genau das habe ich auch so erlebt, durch das Anlegen von Vakuum schäumt das Tensid-haltige Wasser etwas auf, so dass viele Samen am Rand trocken hängen bleiben. Ich konnte so erst nach 19 h aussäen.

Wie ist nun das Ergebnis? Kann ich immer noch nicht sagen. Es sieht nicht so aus, als ob Samen keimen, bei einigen ist stärkere Quellung aufgetreten, so dass eine geringe Hoffnung besteht. Bill gibt ja 3-4 Monate für die Keimung an.

Ich hatte die Aussaat der neuen Samen vom September 2010 so lange aufgeschoben, bis ich eine Aussaage über diese Aussaat vom Dez. 2010 habe und werde daher in Kürze die neuen Samen aussäen. Dabei will ich versuchen, die Vakuumbehandlung so durchzuziehen, dass ich noch am gleichen Tag bleichen und aussäen kann. Ich vermute, dass die Vakuumbehandlung bei mir zu lange dauerte.

Und zum Aussaatmedium muss ich nochmal mit Bill Kontakt aufnehmen. Im Gegensatz zu seiner Veröffentlichung nimmt er heute kein Ammoniumnitrat mehr, dafür mehr Caseinhydrolysat. Ich habe aber in alten Protokollen von mir aus der Anfangszeit Keimungen bei Epipactis helleborine gehabt, bei denen die Nährböden noch Ammoniumnitrat enthielten. Heute, mit meinen ammoniumfreien Medien hat nie wieder etwas gekeimt. Vielleicht brauchen manche Arten doch Ammonium.   

[Claus]

Diese erste Aussaat von Cyp. arietinum ging in die Hose. Zwar hatte ich die Aussaat 3 Monate dunkel gehalten, aber dann zeigten sich wirklich nur 2 ganz winzige Protokorme. Nach dem Umlegen - dazu brauchte ich ja Licht - regte sich nichts mehr. Ich weiß heute, dass ich da den falschen Nährboden genommen hatte.

Am 31.01.12 habe ich erneut ausgesät. Ich hatte mir dazu zwei Nährböden gekocht, zum einen nach meinem Rezept, zum andern nach Bill Steele. Als Hormon setzte ich meta-Topolin in Mengen von 0,3 und 0,5 ppm ein. Dieses Hormon soll nicht beständig bei der Sterilisation sein, aber ich habe ja Wirkungen gefunden und hatte auch Erfolge bei anderen Cypripedien. Was bei diesem Hormon auffällt, es lässt offenbar Embryonen keimen, tötet sie dann aber ab, sie bleiben ganz klein und werden schwarz. Daneben gibt es dann aber auch gut gekeimte Protokorme, die sich auch weiter entwickeln - gilt für diese anderen Cyp.-Arten.

Die Gläser wollte ich diesmal exakt 4 Monate total im Dunkeln lassen, also wäre der 31.5.12 das entscheidende Datum gewesen. Am 28.5. dachte ich so bei mir, auf 3 Tage kommt es nun auch nicht an und schaute mir die Gläser im gedämpften Licht an. Ergebnis: 29 Protokorme, meist gut ausgebildet. Ich habe dann weiter alles dunkel gehalten und nun heute nach wieder einem Monat erneut kontrolliert: 35 Protokorme, zum Teil bereits mit beginnender Wurzelbildung, es scheinen auch noch Nachkeimungen zu kommen.

Und nun kommt es: Auf meinem CAK-Boden mit Kartoffel, Ananas und Kokos gab es fast keine Keimung. Die wesentliche Keimung fand in nur 2 Gläsern mit Steele-Boden sowohl mit 0,3 als auch mit 0,5 ppm m-Topolin statt, aber es gab auch Gläser mit Steele-Boden ohne jede Keimung. Gebleicht wurden die Samen mit 0,5% NaOCl und zwar 70 min im ersten und 45 min im zweiten Versuch. Dabei gab es wieder nur diese schon beschriebene halbkugelartige Entfärbung der Embryonen, die von Bill Steele beschriebenen äquatorialen braunen Ringe habe ich wieder nicht gesehen. Die Protokorme sind jetzt wesentlich größer als die beiden aus der früheren Aussaat.

Ob diese bessere Keimung nun am m-Topolin lag möchte ich bezweifeln. Bill Steele hat ja mit Kinetin auch gute Ergebnisse gehabt. Ein wesentlicher Faktor ist der absolute Ausschluss von Licht während der Keimungsphase. Und nun frage ich mich natürlich, ob diese Lichtempfindlichkeit, die ja auch Hanne Rasmussen schon beschrieben hatte, nicht auch viel grundsätzlicher gilt. Jedenfalls werde ich in einem nächsten Versuch diverse Samen jeweils 4 Monate nach der Aussaat in Ruhe lassen und nicht unter meiner Halogenlampe beäugen - auch wenn es schwer fällt. 

[Berthold]

Claus, diese angebliche extreme Lichtempfindlichkeit halte ich für unwahrscheinlich.

[Claus]

Claus, diese angebliche extreme Lichtempfindlichkeit halte ich für unwahrscheinlich.

Das ist mir auch schon von anderer Seite so bestätigt worden.  Wie gesagt, bei Hanne Rasmussen kann man das auch nachlesen. Und schließlich habe ich es jetzt auch selbst erlebt.

Ich habe vor ein paar Jahren auch mal Neottia auf B1 ausgesät und in der Tat einen Sämling erhalten. Der war dann relativ schnell auf ca. 1,5 cm angewachsen und bildete eine Spitze. Ich wollte ihm etwas Gutes tun und stellte das Glas ans Licht. Nach 3 (!!!) Tagen wurde der Sämling schwarz. Eigentlich Schwachsinn; denn Neottia wächst ja im Dunkeln und macht keine Photosynthese. Aber das war ja noch in meinen Anfängerjahren.

Es ist natürlich die Frage was ist extrem? Ich habe die Gläser bisher unter einer Halogenlampe gesichtet, das ist sicher extrem. Das Glas mit der Neottia bekam zeitweise Sonne ab. Da könnte es auch an der Wärmeentwicklung liegen.

Es spricht aber sicher nichts dagegen, die Aussaatgläser in einer breit gefächerten Arten-Reihe einmal 3 oder 4 Monate im Dunkeln zu lagern und seine Neugier inzwischen zu zügeln.