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Symbiotische Aussaat

Begonnen von Berthold, 13.Sep.08 um 12:57 Uhr

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Berthold

Zunächt einige grundsätzliche Überlegungen zu symbiotische Aussaat

Bei der In-vitro-Aussaat sehe ich drei grundsätzlich unterschiedliche Abläufe der Samenkeimung:

1. Der Nährboden enthält nur Haferflocken und einen Pilz. Der Pilz verstoffwechselt die Haferflocken und seine Hyphen wachsen in den Orchideensamen oder dessen Rhizoiden hinein. Die Pilzhyphen werden vom Samen als Eindringlinge empfunden und enzymatisch aufgelöst. Dabei gelangen Kreislaufprodukte des Pilzes in den Samen hinein und dienen dort als Nährstoffe für die Entwicklung des Orchideenprotokorms. Ich nenne diesen Ablauf aktive symbiotische Keimung.

2. Der Nährboden enthält nur Haferflocken und einen Pilz. Der Pilz verstoffwechselt die Haferflocken und hinterlässt seine Stoffwechselprodukte im Nährboden zurück. Seine Hyphen können aber nicht in den Orchideensamen hinein wachsen. Der Orchideensamen nimmt durch Diffusion die für ihn zur Keimung notwendigen Komponenten aus den Stoffwechselprodukten des Pilzes auf und keimt. Ich nenne diesen Ablauf passive symbiotische Keimung.

3. Der Nährboden enthält eine komplexe Mischung aller für die Keimung der
Orchideensamen notwendigen Komponenten. Der Samen nimmt durch Diffusion alle     
notwendigen Komponenten auf und keimt. Hier handelt es sich um eine asymbiotische Keimung.

Der Fall 1 wird bei der symbiotischen Aussaat angestrebt. Im Idealfall läuft die Keimung genau so ab. Aber es gibt sehr viele Hindernisse, die einem in der Realität das Leben schwer machen können:

a) der Pilz schafft es nicht, in den Samen einzudringen
b) der Pilz ist zu kräftig und verstoffwechselt den Orchideensamen komplett mit
c) der Pilz schafft es nur anfänglich in den Samen einzudringen. Wenn das Protokorm eine gewisse Grösse erreicht hat, lässt es die Pilzhyphen nicht mehr einwachsen und dreht sich somit seine eigenen Versorgungsleitungen ab
d) Der richtige geeignete Mykorrhiza-Pilz befindet sich nicht im richtigen Aktivitätszustand und kann seine Aufgabe nicht erledigen
e) Durch falsche Temperaturführung oder falsche Futterversorgung wird der Mykorrhizapilz zu aktiv oder zu träge
f) bei unsauberem Arbeiten entwickeln sich im Glas neben dem eigentlichen Mykorrhiza-Pilz andere Pilze oder Bakterien, die den gesamten Keimvorgang zum Erliegen bringen.

Unter den Bedingungen c) schaffen es manche Orchideenarten nach längerem Stillstand des Protokormwachstums das Wachstum wieder aufzunehmen. Wahrscheinlich haben sich dann genügend Pilz-Stoffwechselprodukte im Nährboden gebildet, von denen sich die Orchidee ernähren kann. Es findet dann ein Übergang zu der passiven symbiotischen Keimung statt.

Weniger gelobt ist genug kritisiert (frei nach Peter Altmaier)

Berthold

#1
Die symbiotische Aussaat ist sehr einfach und unproblematisch. Als Medium nimmt man destilliertes Wasser mit 2,5g gemörserten Haferflocken und 7g Agar pro Liter. Alles muss im Drucktopf etwa 30 Minuten sterilisiert werden. Man öffnet die Gefässe nach dem Erkalten und impft unter unsterilen Bedingungen mit einem kleinen Stückchen Pilzagar (0.2 cm³ reicht aus) und verschliesst das Gefäss. Nach etwa 1 Woche bei Zimmertemperatur muss man Pilzhyphen am Gefässrand erkennen können, sonst ist der Pilz nicht angewachsen oder infiziert.
Nach 1 Woche öffnet man das Gefäss und streut Samen hinein (alles unsteril). Dann sieht das nach weiteren 3 bis 5 Wochen so aus:

Letztes Foto: Orchis coriophora auf dem Pilz B1 nach 5 Wochen


Man braucht folgendes Werkzeuge am Arbeitsplatz

Weniger gelobt ist genug kritisiert (frei nach Peter Altmaier)

Berthold

Wenn man Samen auf den Pilz aussät und es entstehen Protokorme, sollte man natürlich wissen, ob es sich um eine aktive symbiotische Keimung, d.h. die Pilzhyphen sind in das Protokorm hinein gewachsen und lassen dort ihre Närstoffe ab oder ob es sich um eine passive symbiotische Keimung, d. h. die Protokorme ernähren sich nur von den Stoffwechselprodukten der Pize im Agar durch reine Diffusion, handelt.
In letzterem Falle könnte man auf die Pilze komplett verzichten und Claus motivieren, einen Nährboden mit entsprechenden Bestandteilen zu komponieren.

Man kann die Art der Keimung leicht rausfinden:

Wenn der Samen sehr schnell keimt (z.B. innerhalb einer Woche) sollte man aktive Keimung vermuten, denn die Pilze haben noch nicht sehr viel von den Haferflocken verstoffwechselt. Wenn man ein Protokorm im Glas hochhebt und wieder absetzt und es geht anschliesend ein, muss man auch von aktiver Keimung ausgehen, denn man hat die Pilzhyphen vom Protokorm abgerissen und somit die Versorgungsleitungen gekappt. Bis die Hyphen wieder nachgewachsen sind entsteht ein Versorgungsengpass bei den Protokormen, den sie meist nicht überleben. Das konnte ich so bei Orchis elegans und Habenaria tridactylites nachweisen.

Wenn der Samen erst 6 oder 8 Wochen nach der Aussaat keimt, könnten bereits so viel Pilzstoffwechselprodukte im Agar entstanden sein, dass sich der Orchideensamen von diesen ernähren kann. In diesem Falle dürfte eine Anhebn und Absetzen bei dem Protokorm keinen grossen Schaden verursachen, denn die Nahrungsaufnahme durch Diffusion kann praktisch ungestört weiter laufen.
Ich bitte um Mitteilung, wenn entsprechende Beobachtungen bereits gemacht wurden. Meine Experimente sind noch nicht so weit.
Weniger gelobt ist genug kritisiert (frei nach Peter Altmaier)

Berthold

#3
Zitat von: Charlemann am 25.Sep.08 um 22:11 Uhr
Wofür brauchst Du den kleinen Elefanten. :weird

Michael, das ist mein Glücksbringer.
Da passierte in der Vergangenheit so mancher Erfolg mehr oder weniger zufällig, da braucht man einen solchen Elefanten.

Aber inzwischen habe ich festgestellt, dass zumindest bei einigen Arten die Keimbarkeit durch den Pilz mit dem Alter des Samens stark abnimmt. Frischer Samen, so gerade getrocknet, wird am Besten gekeimt, 5 Monate alter Samen keimt nur noch 1/10 so gut. Bei der asymbiotischen Aussaat scheint die Abnahme der Keimfähigkeit mit zunehmendem Alter wesentlich geringer zu sein.
Weniger gelobt ist genug kritisiert (frei nach Peter Altmaier)

Claus

Zitat von: Berthold am 25.Sep.08 um 22:32 Uhr
Frischer Samen, so gerade getrocknet, wird am Besten gekeimt, 5 Monate alter Samen keimt nur noch 1/10 so gut. Bei der asymbiotischen Aussaat scheint die Abnahme der Keimfähigkeit mit zunehmendem Alter wesentlich geringer zu sein.

Berthold,
du hebst die Samen doch im Kühlschrank auf, oder? Da habe ich bei Zweitaussaaten nach längerer Zeit eigentlich keine Abnahme der Keimfähigkeit bemerkt. Sogar Samen von 1999 von der HOS keimte wider Erwarten in 2006 noch zu fast 100%.

Grüße
Claus
Wer Chemiker werden will, muss Chemie studieren; wer Jurist oder Arzt werden will, muss Jura oder Medizin studieren. Aber um Politiker zu werden, ist lediglich das Studium der eigenen Interessen notwendig. (Max O'Rell)

Berthold

Zitat von: Claus am 25.Sep.08 um 23:14 Uhr
Da habe ich bei Zweitaussaaten nach längerer Zeit eigentlich keine Abnahme der Keimfähigkeit bemerkt. Sogar Samen von 1999 von der HOS keimte wider Erwarten in 2006 noch zu fast 100%.
Grüße
Claus

Claus, im Kühlschrank.
Meinst Du denn auch Aussaat auf Pilz? Ich habe ja nur von der Keimung durch Pilze gesprochen, die vermutlich deutlich abnimmt.
Weniger gelobt ist genug kritisiert (frei nach Peter Altmaier)

Claus

Zitat von: Berthold am 25.Sep.08 um 23:20 Uhr
Meinst Du denn auch Aussaat auf Pilz?
Nein,
ich habe mit der Aussaat auf Pilz keine neueren Erfahrungen, ich habe das wegen der Sterilbank längst aufgegeben.

Claus
Wer Chemiker werden will, muss Chemie studieren; wer Jurist oder Arzt werden will, muss Jura oder Medizin studieren. Aber um Politiker zu werden, ist lediglich das Studium der eigenen Interessen notwendig. (Max O'Rell)

Berthold

Zitat von: Claus am 25.Sep.08 um 23:42 Uhr
Zitat von: Berthold am 25.Sep.08 um 23:20 Uhr
Meinst Du denn auch Aussaat auf Pilz?
Nein,
ich habe mit der Aussaat auf Pilz keine neueren Erfahrungen, ich habe das wegen der Sterilbank längst aufgegeben.
Claus

Claus, das wäre dann doch schon eine schöne Feststellung:

Wer symbiotisch auf den Mykorrhizapilz B1 aussät muss reifen aber nicht älteren als 2 Monate alten Samen verwenden.
Für die asymbiotische Aussaat spielt bei den meisten Arten das Alter des Samens keine grosse Rolle, wenn er im Kühlschrank gelagert ist. 5 Jahre alter Samen keimte ähnlich gut wie frischer.


Kann man das so stehen lassen?
Weniger gelobt ist genug kritisiert (frei nach Peter Altmaier)

Uhu

#8
Bei längeren Lagerungszeiten würde ich den Samen eher bei -18°C (Kühltruhe) einfrieren. Habe bei fast 10-jährigen, eingefrorenen Sambucinasamen noch einzelne Keimungen bekommen. Die frische Saat hat diese Jahr in machen Gläsern asymbiontisch zu gut 50% Keimungen gebracht.
Wegen der guten Keimungen von mehreren Aussaaten in diesem Jahr musste ich Weitere  ersteinmal einstellen, um möglichst viel auf neue Böden bringen zu können. Hab noch ein paar schöne Proben, die im Frost ruhen müssen bis ich wieder Zeit habe. Zum Einfrieren kommen 2-3 Reiskörner mit in die Samentüte.

Gruß Jürgen
Grüße Jürgen

Claus

Zitat von: Charlemann am 25.Sep.08 um 23:52 Uhr
Nur noch asymbiotisch, Claus?

Warum?

Dactys uns A. morio gehen doch auf B1 am besten.

Hallo Michael,
die Keimung dieser Arten auf B1 geht zwar gut, aber die Entwicklung bleibt dann irgendwann stecken. Z.B. bei D. sambucina ist es mir ja bisher nicht gelungen, die symbiotisch gezogenen Pflanzen weiter als bis zum nächsten Frühjahr zu bringen. Asymbiotisch passiert da gar nichts, sie wachsen weiter bzw. gehen im Glas nach Rübenbildung in die Ruheperiode über.

Und die Keimausbeute ist symbiotisch im Vergleich zu asymbiotisch meist deutlich geringer. Es kann sein, dass dadurch die weniger lebensfähigen Exemplare erst gar nicht zur Keimung kommen, ich weiß es nicht.

Es gibt ein weiteres Argument für die asymbiotische Aussaat: Ich kann zwar asymbiotische Sämlinge aus infizierten Gläsern noch versuchen asymbiotisch oder symbiotisch umzulegen, aber umgekehrt geht das nicht.

Ich bin bei der Aussaat inzwischen auch über Dactys und A. morio hinaus, und da geht nur sehr wenig symbiotisch.

Seinerzeit, als ich anfing, erschien mir die symbiotische Aussaat am vielversprechendsten, weil ich zu viele Verkeimungen in den Aussaat- und Umlegegläsern hatte. Und eine Aussaat auf dem Schreibtisch erschien mir auch sehr wünschenswert. Seit ich diese Verkeimungesprobleme gelöst habe, schätze ich die asymbiotische Anzucht erst recht.

Svante Malmgren hat mir mal gesagt, die symbiotische Kultur würde er erst in einem weiteren Leben ausprobieren.  :-D

In diesem Sinne
Claus
Wer Chemiker werden will, muss Chemie studieren; wer Jurist oder Arzt werden will, muss Jura oder Medizin studieren. Aber um Politiker zu werden, ist lediglich das Studium der eigenen Interessen notwendig. (Max O'Rell)

Claus

Zitat von: Berthold am 25.Sep.08 um 23:59 Uhr
Claus, das wäre dann doch schon eine schöne Feststellung:

Wer symbiotisch auf den Mykorrhizapilz B1 aussät muss reifen aber nicht älteren als 2 Monate alten Samen verwenden.
Für die asymbiotische Aussaat spielt bei den meisten Arten das Alter des Samens keine grosse Rolle, wenn er im Kühlschrank gelagert ist. 5 Jahre alter Samen keimte ähnlich gut wie frischer.


Kann man das so stehen lassen?

Berthold,
das weiß ich wirklich nicht. Es kann so sein. Als ich verschiedene Samen von Aaron Hicks im April 2006 asymbiotisch zur Keimung bringen wollte, war die Ausbeute sehr gering bzw. Null. Dann hatte ich bei O. elegans aus anderer Quelle gerade mal 3 Exemplare, die dann auf dem B1 auch noch eingingen. Da habt ihr wesentlich bessere Ergebnisse gehabt. Ich weiß aber nicht wie alt diese Samen waren. Man muss ja davon ausgehen, dass die Samen aus USA in jedem Falle schon relativ alt waren.

Als ich jetzt dieselben Samen aus USA wiederum asymbiotisch aussäte, war die Keimausbeute gigantisch größer. Das könnte aber auch an meinen mittlerweile wesentlich verbesserten Nährböden liegen.

Wir könnten ja mal einen Vergleichsversuch mit definierten Samen machen, die z.B. du, Michael und ich auf B1 und dem gleichen asymbiotischen Boden aussäen. Dazu müssten wir aber auch die entsprechende Menge an Samen haben. Welche Art, die nun nicht so bereitwillig keimt wie D. maculata, käme da infrage?

Grüße
Claus
Wer Chemiker werden will, muss Chemie studieren; wer Jurist oder Arzt werden will, muss Jura oder Medizin studieren. Aber um Politiker zu werden, ist lediglich das Studium der eigenen Interessen notwendig. (Max O'Rell)

Berthold

Von Claus erhielt ich ein Glass mit kleinen Dactylorhiza praetermissa Protokormen angeblich auf sterilisierten, leicht gedünkten und mit B1 infizierten Eichenblättern. Die Protokorme haben sich weiterentwickelt, zwar langsam aber stetig:



Wie sich die Protokorme ernähren, ist mir unklar. Da gibt es 3 Möglichkeiten
- von den dem Eichenlaub zugesetzen Nährstoffen
- von Stoffwechselprodukten, die der Pilz aus den Eichenblättern produziert hat
- oder durch aktive direkte Nährstoffinfusion über die Pilzhyphen ins Protokorm
oder Kombinationen dieser Möglichkeiten.

Ich halte die erste oder die ersten beiden Möglichkeiten für wahrscheinlich.

Von dem infizierten Eichenlaub habe ich ein Blättchen auf sterilisierten Haferflockenagar gelegt. Es hat sich wieder ein Pilzmyzel ausgebildet und Orchis laxiflora Samen ist nach 3 Monaten darauf gekeimt. Es wird wohl ein sauberer B1-Pilz ohne weitere Infektionen an dem Blatt geklebt haben, da auf dem Agar keine weiteren Kontamination aufgetreten sind. Der B1-Pilz hat es also auch auf dem Eichenlaub geschafft, andere Pilze oder pathogene Bakterien fernzuhalten, tolle Leistung, denke ich.
Weniger gelobt ist genug kritisiert (frei nach Peter Altmaier)

Claus

Zitat von: Berthold am 27.Sep.08 um 00:39 Uhr
Von Claus erhielt ich ein Glass mit kleinen Dactylorhiza praetermissa Protokormen angeblich auf sterilisierten, leicht gedüngten und mit B1 infizierten Eichenblättern. Die Protokorme haben sich weiterentwickelt, zwar langsam aber stetig:

Wie sich die Protokorme ernähren, ist mir unklar. Da gibt es 3 Möglichkeiten
- von den dem Eichenlaub zugesetzen Nährstoffen
- von Stoffwechselprodukten, die der Pilz aus den Eichenblättern produziert hat
- oder durch aktive direkte Nährstoffinfusion über die Pilzhyphen ins Protokorm
oder Kombinationen dieser Möglichkeiten.

Ich halte die erste oder die ersten beiden Möglichkeiten für wahrscheinlich.

Von dem infizierten Eichenlaub habe ich ein Blättchen auf sterilisierten Haferflockenagar gelegt. Es hat sich wieder ein Pilzmyzel ausgebildet und Orchis laxiflora Samen ist nach 3 Monaten darauf gekeimt. Es wird wohl ein sauberer B1-Pilz ohne weitere Infektionen an dem Blatt geklebt haben, da auf dem Agar keine weiteren Kontamination aufgetreten sind. Der B1-Pilz hat es also auch auf dem Eichenlaub geschafft, andere Pilze oder pathogene Bakterien fernzuhalten, tolle Leistung, denke ich.

Hallo Berthold,
das Eichengemisch war nicht angeblich sterilisiert sondern wirklich (45 min). Es sind auch nicht nur Eichenblätter sondern angegammelte Blätter, Zweige i.w. aus totem Holz, Hobelspäne und Rinde. Als Imprägnierung habe ich meinen Nährboden verwendet, jedoch natürlich ohne Zucker und ohne Agar. Es sind aber alle Nährstoffe enthalten, die Sämlinge zur Entwicklung brauchen, nur nicht der Energielieferant Zucker. Die Energie sollte dann der B1 liefern, nämlich durch Abbau von Holz. Soweit die Theorie.

Tatsächlich entwickeln sich die Sämlinge recht gut, auf Eiche besser als auf Buche. Sie haben bei dir grüne Spitzen, das könnte auf Photosynthese als Energielieferant schließen lassen. Aber wenn man sie dunkel hält, entwickeln sie sich genauso. Diese Möglichkeit der Ernährung scheidet damit aus.

Also, ich denke schon, dass der B1 die Cellulose des Holzes zu Zuckern abbaut, von denen er die Sämlinge entweder direkt durch Symbiose oder indirekt durch Abgabe der Zucker ins Substrat ernährt.

Der B1 hat in diesem Substrat auch keine Konkurrenten, sofern man die Gläser nicht öffnet. Also, da hat sich der B1 nicht gegen andere Pilze wehren müssen.

Es fehlt noch ein Vergleichsversuch, an den ich seinerzeit nicht dachte: Protokorme auf das zwar sterilisierte und imprägnierte, jedoch nicht mit B1 infizierte Gemisch zu legen. Falls die sich dann auch entwickeln liegt es an den durch die Sterilisierung freigesetzten Energielieferanten, was auch immer die sein mögen. Das mache ich dann mal im nächsten Frühjahr/Sommer.

Aber das ist unwahrscheinlich; denn innerhalb weniger Tage bilden die Hyphen um die Protokorme ganz intensive Gespinste, viel intensiver als auf Haferagar. Das konntest du nicht mehr sehen, weil diese Gespinste nach längerer Zeit zurückgehen, vielleicht der Grund für die Wachstumsstockung auf B1 nach längerer Zeit nach dem Motto: Der Pilz merkt, dass er dort nichts holen kann und nur gemolken wird.  :-D

Viele Grüße
Claus
Wer Chemiker werden will, muss Chemie studieren; wer Jurist oder Arzt werden will, muss Jura oder Medizin studieren. Aber um Politiker zu werden, ist lediglich das Studium der eigenen Interessen notwendig. (Max O'Rell)

Berthold

Zitat von: Claus am 27.Sep.08 um 09:35 Uhr
Der B1 hat in diesem Substrat auch keine Konkurrenten, sofern man die Gläser nicht öffnet. Also, da hat sich der B1 nicht gegen andere Pilze wehren müssen.

Viele Grüße
Claus

Claus, ich habe das Glas aber mehrmals geöffnet und es ist dennoch nicht kontaminiert. Also der Pilz leistet schon was.
Weniger gelobt ist genug kritisiert (frei nach Peter Altmaier)

Dieter

Zitat von: Berthold am 27.Sep.08 um 10:35 Uhr
Zitat von: Claus am 27.Sep.08 um 09:35 Uhr
Der B1 hat in diesem Substrat auch keine Konkurrenten, sofern man die Gläser nicht öffnet. Also, da hat sich der B1 nicht gegen andere Pilze wehren müssen.

Viele Grüße
Claus

Claus, ich habe das Glas aber mehrmals geöffnet und es ist dennoch nicht kontaminiert. Also der Pilz leistet schon was.
hey,
ich überprüfe die B1 gläser eigentlich regelmäßig unter dem mikroskop,
und dazu wird natürlich der deckel entfernt vom glas.
da passiert nix mit kontaminierung :-)
wenn was kontaminiert nach der aussaat, dann ist das vom samen.
deshalb desinfiziere ich die samen immer mit H2O2.