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Steriles Arbeiten

Begonnen von Claus, 10.Sep.08 um 10:44 Uhr

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Claus

Hallo,
andernorts hatte ich bereits vor 9 Monaten darüber geschrieben, und danach gab es eine wilde Diskussion, ob dieser Aufwand eigentlich notwendig sei. Jetzt, wie gesagt nach 9 Monaten, muss ich sagen, ein besseres Verfahren habe ich noch nicht gesehen. Die Rate der Verkeimungen ist extrem niedrig geworden, und wenn etwas passiert, so hat es andere Ursachen als diese Methode.

Hier der Beitrag, bei dem ich einige Korrekturen eingebracht habe:
auf dem Gebiet der Verkeimungen habe ich jahrelange Erfahrung, zu Beginn verschimmelten mir bis zu 2/3 meiner Umlegegläser. Und wenn Anfänger unter euch ehrlich sind, dann ist es bei ihnen ähnlich.

Jack gab mir dann Ende 2005 einen entscheidenden Tipp: Mikrozid AF, ein Gemisch aus 35% 1-Propanol, 25% Ethanol und 40% Wasser. In ein solches Gemisch stellte ich dann meine Reagenzgläser mit den umzulegenden Protokormen, damit die Außenfläche, die vom vielen Begrabbeln auf der Suche nach gekeimten Samen völlig verkeimt war, desinfiziert wurde. Auch die Instrumente wurden immer wieder in Mikrozid gebadet, und die Handschuhe von Zeit zu Zeit damit befeuchtet. Schließlich lag auch ein damit getränktes Küchentuch in der Sterilbank, mit dem ich dann einzelne Teile noch abwischen konnte.

Der Ventilator der Sterilbank blies mir dann die Dämpfe direkt ins Gesicht. Ärzte verwenden das Zeug, das auch unter vielen anderen Namen verkauft wird, z.B. zur Hautdesinfektion vor Impfungen oder Infusionen.

Der Erfolg war großartig, die Verkeimungen gingen ganz massiv zurück, vielleicht noch 1 Glas auf 30-50. Wie gesagt, beim Umlegen, bei der Aussaat gab es dank Sterilbank auch ohne Mikrozid fast keine Ausfälle.

Ich bin dann leider allergisch auf diese Mischung geworden, vor allem 1-Propanol ist wohl nicht ganz ungefährlich einzuatmen oder über die Haut aufzunehmen (passiert, wenn die Handschuhe mal ein kleines Loch bekommen).

Damit ich dieses schöne Hobby nicht aufgeben musste, habe ich mich aufs Sofa gesetzt und einen neuen Schlachtplan entworfen. Und da das Ergebnis so toll ist, will ich die Arbeitsvorschrift hier veröffentlichen.

Desinfektion der Sterilbank, sterile Aussaat und Umlegen

Desinfizieren der Sterilbank
Es wird eine Lösung von ca. 0,5% NaOCl hergestellt aus: 70 ml DanKlorix und 280 ml dest. Wasser, dazu kommen ca. 4 Tropfen Spülmittel, danach gut umrühren. Bei Verwendung dieser Lösung sind stets Handschuhe zu tragen, es müssen nicht die sterilen Einmalhandschuhe sein, da die Lösung selbst desinfizierend ist. Die Handschuhe werden nach Gebrauch jeweils mit Wasser aus der Leitung abgespült und mit einem frischen Handtuch abgetrocknet. Zum Arbeiten in der Sterilbank werden aber jeweils sterile Handschuhe verwendet. Ein Teil dieser Lösung wird zum Auswischen der Sterilbank verwendet, 15 min. warten, danach wird der Ventilator eingeschaltet und so lange laufen gelassen, bis bei guter Durchlüftung des Raumes der Geruch nach Hypochloriger Säure weitgehend verschwunden und die Sterilbank trocken ist. Ein zweites Auswischen ist nicht erforderlich, das Hepafilter darf allerdings nicht mit der Lösung in Kontakt kommen.

Die Desinfektion der Gläser findet nach Möglichkeit in einem anderen Raum statt, in dem der Geruch nach Hypochloriger Säure weniger stört, es ist übrigens kein Geruch nach Chlor !!! Es können in einem 250 ml-Messzylinder 5 Gläser gleichzeitig desinfiziert werden. Die Reagenzgläser werden zunächst vom Gummiring und der Frischhaltefolie befreit und in dem Gefäß in die DanKlorix-Lösung getaucht - bis knapp unter das obere Ende der Alukappe. Der Pegelstand muss aber unbedingt unter der Öffnung des Glases liegen, damit ein Eindringen der Hypochloritlösung vermieden wird, sie würde die Sämlinge abtöten. Dann wird ein schwereres Glas, z.B. ein Honigglas, übergestülpt, um die aufschwimmenden Gläser bis zu dieser Höhe einzutauchen. Die Nummern der Gläser werden zweckmäßig oben auf die Alukappe geschrieben, da die auf den Gläsern befindlichen Nummern im Desinfektionsbad leicht zerstört werden.

Nach einer Verweilzeit von mindestens 5 Minuten werden die Gläser unter Verwendung eines mit der DanKlorix-Lösung getränkten Papiertuchs in die Sterilbank gebracht und dort die Alukappe entfernt. Der obere Teil des Glases wird noch mit der DanKlorix-Lösung abgewischt. Schlampiges Arbeiten ist zu vermeiden. Dazu gehören:
- Hineinlangen in den hinteren Bereich der Sterilbank über offene Gläser bzw. offen auf der Alufolie liegende Protokorme hinweg
- Umlegen nacheinander in eine zu große Anzahl von Gläsern ohne zwischenzeitliche Desinfektion der Werkzeuge
- Berühren der inneren Glaswand mit dem Handschuh
- Berühren von nicht sterilen Gegenständen nach Anziehen der sterilen Handschuhe, z.B. Uhr, Brille oder andere Gegenstände
- zu langes Liegenlassen von offenen Protokormen auf der Alufolie in der Sterilbank, andernfalls zwischenzeitlich zurück in das Glas

Jetzt auch getestetes Verfahren: Rundgläser werden ebenfalls vom Gummiring und der Frischhaltefolie befreit und in die DanKlorix-Lösung getaucht. Dabei ist darauf zu achten, dass keine Lösung in das mit dem Wattestäbchen verschlossene Loch eindringt. Dazu wird ein Stück Paketklebeband abgerissen und fest auf den Deckel gedrückt, damit das Loch mit dem darin steckenden Wattestäbchen sicher ringsherum abgedeckt wird. Die Gläser werden in der Lösung so gekippt, dass Lösung auch unter das Labyrinth des Deckels eindringt, Luftblasen müssen dort aufsteigen. Nach dem Verlagern der Gläser in die Sterilbank und Öffnen wird der obere Glasrand noch mit DanKlorix-Lösung abgewischt. Der Transport zur Sterilbank kann wie bei den Reagenzgläsern beschrieben mit Unterstützung durch das getränkte Papiertuch erfolgen, damit nichts auf den teuren Perser tropft.  :-D

Bei der Aussaat wird ja nur mit sterilen Gläsern, Instrumenten bzw. Alufolien gearbeitet. Daher ist das bisherige Verfahren geeignet. Alkohole werden dabei überhaupt nicht verwendet.

Beim Umlegen aus Reagenzgläsern habe ich jetzt noch weniger Verluste, weil DanKlorix natürlich noch stärker desinfiziert als Alkohole. In jedem Fall konnte ich bei dennoch aufgetretener Verkeimung eigene Fehler nachvollziehen.

Eine Allergie gegen die Hypochlorige Säure ist unwahrscheinlich, bei gutem Durchlüften des Raums ist der Geruch auch rasch verschwunden.

Es gibt natürlich viele Verfahren des sterilen Arbeitens, aber das hier beschriebene ist einfach, ungefährlich und sehr sicher.

Viele Grüße
Claus
Wer Chemiker werden will, muss Chemie studieren; wer Jurist oder Arzt werden will, muss Jura oder Medizin studieren. Aber um Politiker zu werden, ist lediglich das Studium der eigenen Interessen notwendig. (Max O'Rell)

Ahriman

Hallo Claus!

Danke für den Bericht!
Eine Frage - wie lang bleibt die Desinfektionswirkung der NaOCl-Lösung gewährleistet bevor sie zerfällt?

Ich bin immer noch am rumprobieren da ich nach wie vor mit einer weißen schleimigen Kontamination zu kämpfen habe die extrem raschwüchsig und hochgradig pflanzenpathogen ist. Woher sie kommt ist mir nicht klar, mal sind fast alle umgelegten Gefäße betroffen, dann man wieder kein einziges. Es ist aber nur diese eine Kontamination, klassische Bakterienklonien oder Schimmel habe ich praktisch nie.

Bei Kontamination wird das Kulturgefäß binnen 2 Tagen von trübweißem Schleim bzw. einer milchigen Flüssigkeit überzogen, die Pflanzen sind nur noch glasiger Matsch.

Ich arbeite normalerweise mit 70% Ethanol und teilweise mit Lysoform (unbrennbar, ein gewisser Vorteil wenn man Reagensgläser abflammt).
Werde die von dir beschriebene DanKlorix Prozedur mal testen, MikrozidAF wäre mir auf Dauer zu teuer (oder bekommt man das wo günstig?)

Schöne Grüße,
Christian

Berthold

Zitat von: Ahriman am 15.Sep.08 um 00:44 Uhr
Ich bin immer noch am rumprobieren da ich nach wie vor mit einer weißen schleimigen Kontamination zu kämpfen habe die extrem raschwüchsig und hochgradig pflanzenpathogen ist. Woher sie kommt ist mir nicht klar, mal sind fast alle umgelegten Gefäße betroffen, dann man wieder kein einziges. Es ist aber nur diese eine Kontamination, klassische Bakterienklonien oder Schimmel habe ich praktisch nie.

Bei Kontamination wird das Kulturgefäß binnen 2 Tagen von trübweißem Schleim bzw. einer milchigen Flüssigkeit überzogen, die Pflanzen sind nur noch glasiger Matsch.
Schöne Grüße,
Christian


Christian, ein solcher Schleim bildet sich manchmal in meinen symbiotischen Aussaatgefässen, ca. eine Woche nach der Infizierung mit dem Pilz. Dann wird sofort der Pilz aufgelöst und das Gel wird wieder im Glas frei beweglich, während es von den Pilzhyphen wie angewachsen im Glas festgehalten wird.
Ich vermute es handelt sich um eine bakterielle Infektion.
Weniger gelobt ist genug kritisiert (frei nach Peter Altmaier)

Berthold

#3
ein einfacher aber sehr effektiver Arbeitsplatz für die sterile asymbiotische Aussaat und das Umlegen:

Es wird im Dampfstrom des leicht siedenden Wassers gearbeitet. Der gebleichte Samen befindet sich im Glasröhrchen neben dem Topf in unsteriler Luft. Er wird auch dort mit dem Spatel aus dem Röhrchen entnommen und im Dampfstrom ins Reagenzglas gestrichen. Der sterilisierte Watteverschluss wird im Dampfstrom ins Reagensglas gedrückt, in unsteriler Luft mit Mikrozid AF eingesprüht und mit Klarsichtfolie und Gummiring verschlossen, beschriftet, fertig.
Eine Luftabsaugung über dem Herd verbessert die laminare Wasserdampfströmung nach oben. Leichte Gummihandschuhe als Wärmeschutz sind zu empfehlen.
Die Verkeimungsrate ist äusserst gering. Hauptgefahr besteht durch nicht ausreichend desinfizierten Samen.
Weniger gelobt ist genug kritisiert (frei nach Peter Altmaier)

Claus

Zitat von: Ahriman am 15.Sep.08 um 00:44 Uhr
Eine Frage - wie lang bleibt die Desinfektionswirkung der NaOCl-Lösung gewährleistet bevor sie zerfällt?

Hallo Christian,
spülst du bei der Aussaat mit sterilem dest. Wasser nach? Ich habe das früher auch gemacht, lasse es aber schon seit langem. es kann sein, dass dadurch Keimung verhindert wird, weil die Bleichwirkung im Reagenzglas noch längere Zeit bis zur Totbleiche der Samen andauert. Aber ich vermeide dadurch viele Infektionen.

Wie lange die desinfizierende Wirkung der den Samen anhaftenden Bleichlösung andauert weiß ich nicht.

Hast du das Problem nur beim Umlegen oder auch bei der Aussaat? Arbeitest du mit einer Sterilbank? Ist dort der Luftstrom laminar? (Feuerzeug) Evtl. teilweiser Verschluss durch Scheibe.

Wenn du mit deiner Frage aber meinst wie lange die desinfizierende Wirkung der 0,5%igen Lösung anhält, die ich zum Eintauchen der Gläser benutze, so kann man den Hypochloritgeruch noch den ganzen Tag über vernehmen. D.h. ich setze die Lösung an und benutze sie für den gesamten Tag, mal nur für einige wenige Gläser, mal für zig. Am nächsten Tag, falls ich die Lösung stehen gelassen habe, ist noch ein ganz schwacher Geruch da. Da wird wohl fast alles zerfallen sein.

Viele Grüße
Claus
Wer Chemiker werden will, muss Chemie studieren; wer Jurist oder Arzt werden will, muss Jura oder Medizin studieren. Aber um Politiker zu werden, ist lediglich das Studium der eigenen Interessen notwendig. (Max O'Rell)

Berthold

#5
hier wurde auch steril gearbeitet. Aber dennoch hat sich ca. 2 Monate nach dem Umlegen dieser Schimmel eingefunden. Er kann eigentlich nur durch den kleinen Wattestopfen im Deckel ins Glas gelangt sein, obwohl der Deckel mit Klarsichtfolie und Gummiring verschlossen ist.

In diesem Falle handelt es sich um Calypso bulbosa, der verschimmelte Sämling (und die anderen natürlich auch, da das Glas geöffnet wurde und jetzt infiziert ist) kann in Neudohum gesetzt werden und er wächst langsam weiter.
Weniger gelobt ist genug kritisiert (frei nach Peter Altmaier)

Ahriman

Hallo!

Berthold, ich bin mir nicht sicher was es ist. Es wächst problemlos auf Nährboden mit Breitspektrum-Antibiotika (wobei mir deren genaue Zusammensetzung leider unbekannt ist) und erträgt PPM bis in pflanztoxische Konzentrationen. 3%H2O2 helfen manchmal, meist kehrt die Kontamination aber zurück. Das einzig wirklich effektive war akasept (ein nichttoxisches Guanidinhydrochlorid-Gemisch), welches es früher im Supermarkt als Spray gab, es wird aber nicht mehr verkauft da die Firma Probleme mit der Fertigung der Spraydosen(!) hatte.

Claus, ich spüle nicht mehr nach, das war mir zu mühsam un ein zusätzlicher Faktor für Kontaminationen. Größere Samenmengen desinfiziere ich in einer 2ml Spritze die mit einem kleinen Wattekügelchen verschlossen ist. Nach Abauf der Desinfektionszeit drücke ich die DanKlorix-Lösung aus der Spritze, die Samen können die Watte nicht passieren und bleiben halbtrocken in der Spritze. Danach hole ich sie mit einem Mikrospatel heraus und verteile sie auf die Reagensgläser. Bei winzigen Samenmengen wie sie bei kleinen Kapseln oft anfallen verteile ich diese aber samt der DanKlorix  Lsg per Spritze auf den Nährboden.
Das Problem mit dem totbleichen tritt dabei immer wieder auf sodass ich da hin und wieder doch nachspülen muss - auch wenn das die Samen schon extrem verdünnt.
Hier suche ich noch nach einer besseren Lösung.

Mit 3% H2O2 hatte ich nie so recht Erfolg, die Kontaminationsrate war meist wesentlich höher.

Ich arbeite in einer 60x60x60 Sterilbank, der Luftstrom sollte halbwegs laminar sein. Das mit der Scheibe habe ich mir auch schon überlegt, sicher keine schlechte Idee...

Berthold, zu den nach langer Zeit auftretenden Kontaminationen - bei mir passiert das manchmal (wenn auch selten) wenn man die Gläser bewegt. Möglicherweise sitzen die Sporen bereits vom Umlegen irgendwo am Glas und fallen durch Erschütterungen auf den Nährboden?

LG,
Christian

Berthold

Zitat von: Ahriman am 16.Sep.08 um 01:31 Uhr
Hallo!

Berthold, ich bin mir nicht sicher was es ist. Es wächst problemlos auf Nährboden mit Breitspektrum-Antibiotika (wobei mir deren genaue Zusammensetzung leider unbekannt ist) und erträgt PPM bis in pflanztoxische Konzentrationen. 3%H2O2 helfen manchmal, meist kehrt die Kontamination aber zurück. Das einzig wirklich effektive war akasept (ein nichttoxisches Guanidinhydrochlorid-Gemisch), welches es früher im Supermarkt als Spray gab, es wird aber nicht mehr verkauft da die Firma Probleme mit der Fertigung der Spraydosen(!) hatte.

können das vielleicht irgendwelche Einzeller sein? Ich kenne mich da nicht aus.
Weniger gelobt ist genug kritisiert (frei nach Peter Altmaier)

Claus

Ich habe in meiner Zeit der großen Verschimmelung (60-70% der Umlegegläser verschimmelten) den Fehler gemacht, die Gläser, aus denen umgelegt werden sollte, von außen nicht zu desinfizieren. Diese Gläser wurden ja in kurzem Abstand immer wieder mit mehr oder weniger schmutzigen Fingern angefasst, um den Entwicklungsstand zu prüfen. Außerdem stehen sie bei mir ohne Abdeckung herum.

Insbesondere bei Rundgläsern sammeln sich offenbar Keime unter dem Deckelrand.

Das alles habe ich in die Sterilbank mit eingeschleppt.

Dann kam noch das Problem, das Michael schon ansprach. Wenn ich ein Stück Nährboden mit den Protokormen darauf offen in der Sterilbank liegen habe und dann wieder ein Umlegeglas damit gefüllt habe, darf ich natürlich das gefülte Glas nicht so in der Bank abstellen, dass ich mit der Hand über die noch offen liegenden Protokorme hinweg greife. So lang sind ja die Handschuhe nicht.

Heute ist das besser organisiert. Die Gläser werden mit Hypochlorit desinfiziert, beim Einbringen in die Sterilbank nochmals oben am Rand mit Hypochlorit getränktem Papiertuch abgewischt, und über die offen liegenden Protokorme greife ich natürlich auch nicht mehr hinweg. Und die Werkzeuge werden zwischen den Arbeitsgängen auch mit diesem getränkten Tuch abgewischt.

Es gibt übrigens Glasperlensterilisatoren, da werden die Werkzeuge zwischendurch hineingesteckt und durch Hitze desinfiziert. Die Geräte sind allerdings recht teuer, und ich komme jetzt auch so gut zurecht.

Was bleibt ist der Fakt, den Berthold schon ansprach. Die Frischhaltefolie und der Wattestopfen sind noch Schwachstellen. Daran arbeite ich noch, weil ich nicht wieder mit den Alkoholdämfen arbeiten will. Es gibt Alternativen.

Grüße
Claus
Wer Chemiker werden will, muss Chemie studieren; wer Jurist oder Arzt werden will, muss Jura oder Medizin studieren. Aber um Politiker zu werden, ist lediglich das Studium der eigenen Interessen notwendig. (Max O'Rell)

Claus

Zitat von: Charlemann am 17.Sep.08 um 16:47 Uhr
Ich habe ein Glas mit MikrozidAF in der Bank stehen. Sobald ich ein Instrument nicht (mehr) benötige stelle ich das da hinein zur Zwischendesinfektion.

Ja, so habe ich das auch gemacht. Jetzt steht entsprechend ein Glas mit 0,5%iger NaOCl-Lösung in der Bank, und ich wische die Instrumente nach dem Eintauchen mit einem Papiertuch ab, das auch mit Hypochlorit getränkt ist. Also, die beiden Verfahren sind gleichwertig, aber ich darf eben die Alkoholdämpfe nicht einatmen.

Grüße
Claus
Wer Chemiker werden will, muss Chemie studieren; wer Jurist oder Arzt werden will, muss Jura oder Medizin studieren. Aber um Politiker zu werden, ist lediglich das Studium der eigenen Interessen notwendig. (Max O'Rell)

Claus

Rhythmusstörungen, nicht so schön.

Claus
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Berthold

#11
Steriles Arbeiten, so nicht:


ja, was haben wir uns da wieder eingefangen? Ist es ein Pilz, sind es Bakterien oder Einzeller?

Mit 400-facher Vergrösserung sieht es so aus:


Es riecht nach Käse und die kleinen Kerle bewegen sich. Also eine Hefe ist es schon mal nicht, die sollte Ketten bilden und keine einzelnen Körner und bewegen tut sie sich auch nicht.
Aus Milch können die Bakterien ja ganz gut Milchsäure machen, aber wie bekommen sie aus Deinem Boden, Claus, den Käsegeruch hin? 
Weniger gelobt ist genug kritisiert (frei nach Peter Altmaier)

Claus

Zitat von: Berthold am 09.Nov.08 um 23:45 Uhr
Steriles Arbeiten, so nicht:
ja, was haben wir uns da wieder eingefangen? Ist es ein Pilz, sind es Bakterien oder Einzeller?

Mit 400-facher Vergrösserung sieht es so aus:
Es riecht nach Käse und die kleinen Kerle bewegen sich. Also eine Hefe ist es schon mal nicht, die sollte Ketten bilden und keine einzelnen Körner und bewegen tut sie sich auch nicht.
Berthold,
das sieht nach Hefe aus. Die müssen auch nicht immer gleich aussehen, es gibt da wilde Typen. Und die stinken vor allem!!! Wenn das eines der Gläser der Satyrium pumilum war, die waren ja fast alle versifft, dazu habe ich mich ja schon geäußert. Bakterien will ich aber nicht ausschließen. Ist eigentlich auch egal, wovon den Embryonen schlecht geworden ist. Ein gewisser Schwund ist eben immer!  :whistle

Und Bewegung? Bei 400-facher Vergrößerung vermutlich Brownsche Molekularbewegung: http://schulen.eduhi.at/riedgym/physik/10/waerme/temperatur/brownsche_bewegung.htm

Sonst wären es ja Amöben oder son Zeug.

Viele Grüße
Claus
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rudorch

Ich behaupte weiterhin: Pseudomonas

"Sie können sich mit einer oder mehreren polaren Geißeln aktiv bewegen..."

"Die Gattung ist klinisch besonders wichtig, weil die Mehrheit ihrer Mitglieder Resistenzen gegen Antibiotika aufweist."

Siehe hier:
http://de.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas

Kontaminierte Gläser, egal mit was, schütte ich nicht einfach so aus. Die werden alle erst 50 Minuten autoklaviert. Ich dürft mich jetzt gerne Weichei nennen, aber vor dem Mikrokosmos habe ich den größten Respekt.

Viele Grüße
Klaus

Berthold

#14
also ich finde, man sollte schon wissen wovon einem schlecht wird.

Einzeller können wir ausschliessen, denn die liegen zwischen 100 und 500 µ, also etwa so gross wie Orchideensamen. Diese Körner hier liegen im Bereich von 1 bis 10 µ.
Das würde zu Bakterien und auch zu Hefezellen passen. Hefen bilden aber normalerweise Ketten aus solchen einzelnen Zellen. Hier gibt es überhaupt keine Ketten sondern nur einzelne Zellen.
Pseudomonas sind eigentlich etwas stabförmig, während dieses Ungeziefer mehr eiförmig erscheint. Gibt es da vielleicht auch eiförmige Arten von?

Claus, es ist Satyrium pumilum von der Waslroder Aussaat. Was hast Du Dir da blos eingefangen?
 
Klaus, wenn man die Geräte und Gefässe vor der Aussaat mit 120° 20 Minuten im Drucktopf sterilisiert, sollte da doch alles hin sein. Oder hast Du Bedenken, dass Deine gesamten Räume versiffen?

Gruss Berthold

p.s. Claus, Dein Link zu der brownschen Molekularbewegung tötet spontan meinen Browser (IE7). Hast Du da irgenwelche Schweinereien verlinkt?
Weniger gelobt ist genug kritisiert (frei nach Peter Altmaier)