Meristemvermehrung

Begonnen von Volzotan, 12.Feb.10 um 22:05 Uhr

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Volzotan

Hi Leute,
wer hat denn hier im Forum schonmal an Meristemvermehrung gearbeitet und das nicht nur als Nebeneffekt der In-vitro-Aussaaten.

Ich habe letztes Jahr zum ersten Mal eine adulte Laeliocattleya Mini Purple geklont indem ich meristemmatisches Gewebe aus einem Neutrieb freipäpariert, desinfiziert und auf Nährboden übertragen habe.
Als Anleitung diente mir das Buch Materials and Methods of plant tissue culture, ein recht alter Schinken aus der Unibibliothek, der alles andere als den neusten Stand der Technik widergab, aber funktioniert hat es trotzdem.

Die grobe Methodik kann man sicher allgemein für alle Sympodialen beschreiben... also dann:
Der Neutrieb sollte noch nicht bewurzelt sein und die äußeren Blätter dürfen sich noch nicht öffnen.

Als erstes entfernt man unsteril die Blätter, indem man vorsichtig am Ansatz der Blätter entlangschneidet, nicht zu tief schneiden, genau unter diesem Punkt liegt das Gewebe das man zum Klonen braucht.
Ich habe bei meinen ersten Versuchen immer 3 Nodien pro Neutrieb gefunden.
Wenn dann alle Nodien am Neutrieb frei liegen, wird der ganze Trieb für 10min in 0,5% NaOCl-lösung desinfiziert und dann in eine Pufferlösung (Phosphatpuffer nach Sörensen pH 5,5) getaucht. Die Pufferlösung ist natürlich auch sterilisiert worden.
Nun schneidet man die Nodien heraus und tut sie sofort wieder in die Pufferlösung, das Gewebe kann schnell oxidieren und ist dann hin.

Nun kann man die Nodien auf Nährboden übertragen.
Ich habe als Grundlage die Makro und Mikronährstoffen des Bernertmediums verwendet.
Das ersten Nährmedium (Initiation Medium) enthält viel Cytokinin (BAP 1,8mg) und wenig Auxin (NAA 0,19mg). Es enthält auch sehr wenig Zucker, das waren nur so 2g wenn ich mich richtig erinnere, müsste ich nachschauen.

Die geringe Zuckerkonzentration wird mit der Osmolarität des Zuckers zusammenhängen, an dem frisch präparierten Gewebe liegen die Zellen an der Schnittstelle frei, hohe Zuckerkonzentration könnte eine Nährstoffaufnahme verhindern oder gar Wasser aus dem Gewebe entziehen.

Die Nodien werden mit der Schnittstelle nach unten in das Medium gedrückt, sodass die Spitze noch rausschaut, die Schnittstelle aber von Medium bedeckt ist.
Wenn alles glatt geht, sterben die Nodien nicht ab und beginnen nach einigen Tagen zu wachsen, das dauert recht lange und große Prolieferation findet auf diesem Medium nicht statt.
Wer sich die Mühe mit den Nährmedien sparen will, kann bei Sigma auch Multiplication-Medium kaufen, das funktioniert auch in der Startphase hatte ich aber den Eindruck, das das selbst gekochte Medium etwas besser war.
Bei meinen Versuchen sind etwa 2/3 der Explantate angewachsen. (Bild 1)

Wenn die Explantate ihre Größe etwa verdoppelt haben werden sie erneut zerschnitten und auf ein Proliferation-Medium übertragen. Dieses enthält mehr NAA als BAP und soll die Entwicklung von Callus bewirken. Auch das ging recht langsam von Statten, ich habe gehört andere synthetische Auxine sind da wirksamer.

Man kann die Gewebe auch wieder aus Sigma-Medium übertragen, das enthält 2mg BAP und 0,5mg NAA, entspricht also mehr dem Initiation-Medium. Auf dem Medium entstehen große Zellklumpen die wie entartete Protokorme aussehen (PLB's) und die auch schnell Sprosse bilden, logisch bei soviel BAP. Man muss also recht häufig schneiden und neu Umlegen.

Das Schneide und Umlege-Spiel kann man so lange treiben bis man so viel Pflanzenmaterial hat wie man mag.

Nun betrachten wir das ganze mal etwas kritisch, ich habe keine Flüssigkultur auf Schüttlern gemacht. Das bewirkt, das sich das Gewebe sehr schnell differenzieren kann, das ganze wird dadurch etwas aufwändiger, man muss ich Flüssigkulturen wohl nicht so oft schneiden und umlegen, das wächstum soll wohl auch schneller sein.

Trotz aller tollen Berichte die man so hört dauert das alles ungefähr genauso lange wie eine Aussaat, zumindest bei Cattleya, vorteil ist man weiß was man für einen Genotypen im Glas hat, für die Reproduktion diverser coeruleas, flavas und albas ist das wichtig.
Ihr habt ja bei den Sophronites eben erst wieder euer Leid geklagt.

So nun möchte ich ein paar Anregungenhören was ich verbessern kann, Frodo du hast doch da sicher auch schon Erfahrung mit.
Ich habe von April 2009 bis heute aus 2 Explantaten von LC Mini Purple coerulea etwa 5 Gläser (Bild 2 u. 3) voller Klone produzieren können, die ich jetzt auf normale Medien zum bewurzeln geben werden. Das macht über den Daumen gepeilt 100 Pflanzen.

Gruß Roman


Solanum

Hey Volzotan, ich hab das mal mit Phalaenopsisnodien gemacht, siehe hier:
http://forum.orchideen-forum.de/showthread.php?t=32954

Offenbar braucht man aber für die Meristemvermehrung gar keine Nodien, alle möglichen Stammzellen können durch die richtigen Phytohormone dazu angeregt werden, protocorm-like bodies (PLBs) zu bilden. Es gibt Publikationen für fast jedes Gewebe (Blätter, Wurzelspitzen, nur Blüten nicht  :-p). Aber in den meisten Fällen wird das in Flüssigkultur gemacht, weiß nicht, wie effektiv die Methoden auf Festmedium sind. Mich hat es schon öfter in den Fingern gejuckt, mal aus einem Blatt eine Nopse zu klonen, nur um es ausprobiert zu haben, aber dafür hat leider die Muße bisher nicht gereicht.

Timm Willem

Hallo Roman,
ich denke, die Medien sind sehr geschickt gewählt.
Wofür brauchst Du diese Pufferlösung?
Flüssigkulturen haben den Vorteil, dass es etwas schneller geht, als auf festem Medium.
Viele Grüße
Timm

Volzotan

Hi Timm,
die Pufferlösung ist aus der Anleitung in dem Buch entnommen, da wurde davor gewarnt, dass die frisch entnommenen Nodien schnell oxidieren können wenn man sie nicht in dieser Pufferlösung badet.

Gruß Roman

Timm Willem

Hallo Roman,
Zitat von: Volzotan am 13.Feb.10 um 11:58 Uhr
die Pufferlösung ist aus der Anleitung in dem Buch entnommen, da wurde davor gewarnt, dass die frisch entnommenen Nodien schnell oxidieren können wenn man sie nicht in dieser Pufferlösung badet.
Das kann natürlich sein, es ist aber nicht so ausschlaggebend, denke ich.

Du hast ja Meristeme entnommen, warum gehst Du danach über eine Kallusphase?
Warum schneidest Du das Explantat so klein, würde es nicht auch etwas gröber funktionieren, Du willst es ja nicht von Viren befreien?

Volzotan

Das Explantat ist immer ein komplettes Nodium, aus der Literatur die mir zur verfügung steht kenne ich es nicht anders. Möglicherweise kann man auch etwas mehr Gewebe um das Nodium dran lassen.
Die Kallusphase ist da um genug undifferenziertes Gewebe zu schaffen, sodass man dann wirklich mal ein paar hundert Pflanzen produzieren kann.

Timm, wenn du Meristemgewebe vermehrst, regst du das dann gleich so an das somatische Embryonen entstehen, oder wie machst du das? Wäre es eigentlich möglich auch aus Meristemgeweben so eine schöne Embryonensuspension zu machen, in Flüssigkultur?

Gruß Roman

Timm Willem

Hallo Roman,

Zitat von: Volzotan am 14.Feb.10 um 17:22 Uhr
Das Explantat ist immer ein komplettes Nodium, aus der Literatur die mir zur verfügung steht kenne ich es nicht anders. Möglicherweise kann man auch etwas mehr Gewebe um das Nodium dran lassen.
Die Kallusphase ist da um genug undifferenziertes Gewebe zu schaffen, sodass man dann wirklich mal ein paar hundert Pflanzen produzieren kann.

ich versuche jede Kallusbildung zu verhindern. Regeneration aus Einzelzellen versuche ich weitgehend durch Veränderung des Mediums zu unterdrücken. Ich halte es für äußerst problematisch, deshalb vermehre ich bis auf Etablierungsphasen und einige Ausnahmen nur über natürlich angelegte vielzellige Meristeme, erscheint zwar zunächst langsamer, ist aber vom Arbeitsaufwand(Schneiden) günstiger, da die Pflanzen größer sind und gleichmäßiger wachsen.
Bei Arten, Klonen die eine Regeneration aus Einzelzellen genetisch möglich machen, bietet sich eine Etablierung über andere Pflanzenteile an, da ist der Arbeitsaufwand geringer. Die würde man in möglichst großer Zahl, in kleinen Erlen. schütteln lassen, wenn somaklonale Variation auftritt, ist sie statistisch in der Produktion enthalten, aber nicht unverhältnismäßig.

Zitat von: Volzotan am 14.Feb.10 um 17:22 Uhr
Timm, wenn du Meristemgewebe vermehrst, regst du das dann gleich so an das somatische Embryonen entstehen, oder wie machst du das? Wäre es eigentlich möglich auch aus Meristemgeweben so eine schöne Embryonensuspension zu machen, in Flüssigkultur?
Bei Cypris geht das nicht, sie bilden im Normalfall keinen regenerationfähigen Kallus. Es gibt Ausnahmen, Herr Konrad Koch hatte ein paar Hybrid-Klone gefunden, solche tauchen auch bei mir immer wieder auf, und besonders bei calceolus, da er wenig Phenole bildet wird der Kallus nicht ständig vergiftet.
Som. Embryonen entstehen nur bei sehr wenigen Cypri-Sämlingen, dann meist nur unter großem Zwang. Bekannt sind einige Kallusstämme bei calceolus, dort kann man aber som. Embryonen und andere Regeneration nicht gut trennen.
Vor kurzem habe ich einen Sämling(Dreifachhybride) gefunden, der bei sehr geringer Zugabe von Wachstumsregulatoren direkt lebensfähige som. Embryonen erzeugt, das wurde noch nie veröffentlicht und war absolut unbekannt. 

Embryonensuspension bei Cyclamen war eine Zufallsentdeckung, das ging nur weil der Kallus so weich war, dass er selbstständig in einer Flüssigkeit zerfiel. Wenn es bekannt ist, dass das funktioniert, kann man natürlich bei festem Kallus mechanisch nachhelfen, dafür gibt es aber eine Bedingung, der Klon darf keinerlei giftige Ausscheidungen Produzieren, egal bei welcher Pflanzenart.
Bei Erdorchideen ist som. Embryogenese als PLB bei Dactylorhiza sehr häufig und auch sehr lästig, das Nachproliferieren bei der Aussaat ist ein Anzeichen dafür, dass dort neben normaler Regeneration möglicherweise auch Sämlingsklone zur somatischen Embryogenese fähig sind.

Das schlechte Foto zeigt einen Dac.-Klon, der ,,saubere" som. Embryonen ohne Kallusphase hervorbringt. Der Klon ist sehr schön, da die Embryonen gleichmäßig auswachsen und nur entstehen wenn man sie haben möchte. Ich würde daraus aber keine Suspension erzeugen wollen.

Viele Grüße
Timm

Volzotan

Du regst also Cypripedienprotokorme so an das viele Sprosse entstehen und teilst dann die Pflanzen?
Wie verhält sich das mit dem Stress dadurch, viele Cypripedien vergiften sich ja so schon gerne selbst, wird das durch das Schneiden nicht noch schlimmer?

Hast du schon versucht adulte Pflanzen wieder in die Flasche zu bringen? Ich habe gehört mit Wurzelspitzen geht das, aber es ist Schwierig.

Gruß Roman

Reinhold

Hier bin ja unter den Experten.
Deswegen möchte ich, als Nicht-Experte, schnell eine Frage loswerden, auch wenn sie möglicherweise nicht genau zum Thema paßt?
Einverstanden?

Ich habe gestern in einem Buch von Walter Richter gelesen,
dass man den Effekt der Meristemvermehrung bei Paphiopedilum durch einen Kreuzschnitt im Kreiselstadium erzeugen kann?

Sagt Euch das was?
Gruß
Li.
Im Forum steht alles; auch das Gegenteil.

Timm Willem

#9
Zitat von: Lilith am 15.Feb.10 um 13:16 Uhr
Hier bin ja unter den Experten.
Deswegen möchte ich, als Nicht-Experte, schnell eine Frage loswerden, auch wenn sie möglicherweise nicht genau zum Thema paßt?
Einverstanden?

Ich habe gestern in einem Buch von Walter Richter gelesen,
dass man den Effekt der Meristemvermehrung bei Paphiopedilum durch einen Kreuzschnitt im Kreiselstadium erzeugen kann?

Sagt Euch das was?
Gruß
Li.

Meinst Du, nachdem oder bevor der Fluxkondensator auf rot umgeschwungen ist?

Mit der Beschreibung kann ich nichts anfangen, wer ist Walter Richter? Gibt es in seinem Buch aussagekräftige Fotos die seine These unterstützen?
Es gibt nur sehr wenige Veröffentlichungen(fast alle aus China!!!, meist mit wenigen unscharfen Bildern!!! und sehr vielen Zahlen!!!!) über Gewebekulturtechniken bei Paphis, die meisten darauf hinaus laufen, dass sehr viel Hormon auf viele sterile Sämlinge gegossen wurde, es kam daraufhin zur leichten Vermehrung(aus Protokormgewebe) und ein paar Pflanzen wurden ins GWH gebracht. Das ist aber kein Kultursystem, es ist absolut unseriös!

Ich möchte aber ausdrücklich darauf hinweisen, dass es einige Leute gibt, die es können, aber die werden ihr System sicher nicht veröffentlichen.

So nun habe ich Walter gegoogelt, war nicht so einfach, das Buch ist nicht so neu, ich glaube zu dem Zeitpunkt konnte man noch nicht einmal Phalaenopsis verklonen. Walter kann uns wohl auch nicht mehr helfen.

Timm Willem

Zitat von: Volzotan am 15.Feb.10 um 12:30 Uhr
Du regst also Cypripedienprotokorme so an das viele Sprosse entstehen und teilst dann die Pflanzen?
Ich lasse sie erst mal zu normalen Sämlinge heranwachsen und beobachte die Wuchseigenschaften.
Zitat von: Volzotan am 15.Feb.10 um 12:30 Uhr
Wie verhält sich das mit dem Stress dadurch, viele Cypripedien vergiften sich ja so schon gerne selbst, wird das durch das Schneiden nicht noch schlimmer?
Da liegt der Haken bei der Sache, die Jungpflanzen werden sehr teuer, da man sie oft umlegen muss. Wenn es möglich ist Samen zu erzeugen, sind Sämlinge deutlich billiger.
Zitat von: Volzotan am 15.Feb.10 um 12:30 Uhr
Hast du schon versucht adulte Pflanzen wieder in die Flasche zu bringen? Ich habe gehört mit Wurzelspitzen geht das, aber es ist Schwierig.
Ich habe ein paar Klone aus adulten Pflanzen etabliert. Bei vielen Arten ist das aber aus physiologischen Gründen unmöglich. Man braucht eine große Menge an Sprossen für einen erfolgreichen Versuch. Es gibt ein paar Hybriden die leichter gehen.

Das mit den Wurzelspitzen wurde mehrmals versucht, es ist aber immer nur an sterilen Wurzeln erfolgreich gewesen, glaube ich. Du sitzt da erheblich näher an der Quelle, berichte mal, PM.
Viele Grüße 

Reinhold

ICH meine gar nichts. Null Ahnung.

Walter Richter ist ein bekannter, war ein bekannter Orchideenzüchter in der DDR.
Er hat Bücher geschrieben. Eins davon 1986. Und darin steht dieser Satz.
Ich dachte, ein Meristem-Experte könnte die Begriffe vielleicht zuordnen, einordnen:  

"dass man den Effekt der Meristemvermehrung bei Paphiopedilum durch einen Kreuzschnitt im Kreiselstadium erzeugen kann".

Was wäre Kreiselstadium?
Und was wäre Kreuzschnitt?
Und was wäre Effekt bei Paphiodilum erzeugen?

Ich hatte bisher im Kopf, Meristemvermehrung ging bei Paphis nicht?

Gruß
Li.
Im Forum steht alles; auch das Gegenteil.

Timm Willem

Hallo Li,
es tut mir Leid, aber ich kann Dir leider nicht helfen, der Satz klingt für mich nach Quatsch.
Zitat von: Lilith am 15.Feb.10 um 16:33 Uhr
Was wäre Kreiselstadium?
Und was wäre Kreuzschnitt?
Und was wäre Effekt bei Paphiodilum erzeugen?
Vielleicht ist Kreiselstadium = Protokorm
Der Rest kann alles sein.

Es gibt viele Leute, die Versuche mit Paphis machen, aber erst seit etwa zehn Jahren. Bis vor etwa 15-20 Jahren gab es auch bei der Aussaat von Paphis noch ein Qualitätsproblem. Man kannte einfach keine guten Medien und es fehlten die Erfahrungen mit der Kultur.
Verklonte Paphis sind auch noch nicht wirtschaftlich.
Gruß
Timm

Reinhold

Zitat von: Timm Willem am 15.Feb.10 um 17:14 Uhr
Hallo Li,
es tut mir Leid, aber ich kann Dir leider nicht helfen, der Satz klingt für mich nach Quatsch.
...
Also, der Satz wurde 1986 geschrieben, vor über 20 Jahren.
Sorry, Walter Richter war für Vieles gut, aber nicht für Quatsch.
Deswegen warte ich mal auf weitere Antworten.
Gruß
Li.
Im Forum steht alles; auch das Gegenteil.

Timm Willem

#14
Hallo Li,
ich muss mich natürlich entschuldigen, da ich unsachlich gewesen bin.
Mich würde sehr interessieren, was Herr Richter in seinem Buch, da ich es nicht kenne, als Kontext zu seinem Satz gestellt hat(Bilder, Zahlen, Glossar).
Auf Antworten Anderer bin ich auch sehr gespannt.
Viele Grüße
Timm

Li, wenn man sich ansieht, wie oft das Thema aufgerufen wurde, sind wir hier richtig unterhaltsam. Darf ich Dich um die Erlaubnis bitten, hier den Begriff "Schweige-Ameisen" einzuführen? oder viel mehr "Berufs-Schweige-Ameisen", gut, dass ich nicht die Möglichkeiten habe, aber es würde mich sehr reizen, sie mal herauszufiltern.