Sterile Vermehrung adulter Dactylorhiza

Begonnen von Berthold, 05.Nov.11 um 23:23 Uhr

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Charlemann


Timm Willem

Zitat von: Timm Willem am 06.Nov.11 um 10:24 Uhr
Zitat von: Alwin am 06.Nov.11 um 10:02 Uhr
Das würden die Beiden doch nie tun  :rot
Sie schämen sich sicher  wegen der Nährboden Unterlage. :ka
Superabsorber im Medium hilft gegen den störenden Wasserfilm auf der Oberfläche. Nur der restliche Plastikmüll aus den Pampers verstopft die Mülltonne so, dass ich den Nachbarn vorgaukeln musste, wir hätten kleine Kinder im Haus.
Das war natürlich nur ein Scherz.

Wir haben schon die Kinder zu den Kartons auch da.

Sobald ich es schaffe,schreibe ich noch ein paar Ergänzungen hier herein, besonders interessant ist sicher, womit es in der Vergangenheit funktioniert hat.

Charlemann

Zitat von: Timm Willem am 06.Nov.11 um 22:22 Uhr
Sobald ich es schaffe,schreibe ich noch ein paar Ergänzungen hier herein, besonders interessant ist sicher, womit es in der Vergangenheit funktioniert hat.

Womit es nicht funktioniert hat, könnte auch interessant sein.

Timm Willem

Zitat von: Berthold am 05.Nov.11 um 23:23 Uhr
Heute hat uns Simon in die vegetative Vermehrung unter sterilen Bedingungen von Dactylorhiza aus dem Garten eingewiesen.

Das Problem besteht darin, aus der adulten Pflanze omnipotenes Zellgewebe zu gewinnen und dieses Gewebe steril auf sterilen Agarnährboden zu bringen.
Ich fange mal mit dem ersten Post an:
es gibt zwei mögliche Wege nach der Oberflächensterilisation weiter zu verfahren. Eine einfache Vermehrung über entwickelnde axillare Sprossmeristeme oder durch eine mehrstufige Kallusphase(omnipotenes Zellgewebe). Der zu wählende Weg hängt maßgeblich vom genetischen Potential des Klons ab. Dabei ist aus verschiedenen Gründen einer Vermehrung über Meristeme immer der Vorzug zu geben.

Es ist aber so, dass ein bestimmter Klon oft keine Regeneration aus einer einmal begonnenen Kallusphase ermöglicht, oder es sehr schwierig ist einen Klon zur Bildung von austriebsfähigen Axillarmeristemen zu animieren.

In einigen Fällen ist auch bei Dactylorhiza weder der eine noch der andere Weg möglich, Ende des Versuchs, aber das ist wohl bei der Gattung relativ selten.

Timm Willem

Zitat von: Berthold am 05.Nov.11 um 23:33 Uhr
Der Neutrieb wird geschält. Hier erkennt man bereits den Neutrieb für das nächste Jahr. Er ist für die sterile Vermehrung unerheblich.



Die Schälung ist abgeschlossen und hoffentlich ausreichend tief.

Das Ausgangsmaterial war schon sehr suboptimal, vorsichtig gesagt. Die vier Sprosse für die Demonstration waren alle schon viel zu weit entwickelt, die Knospen sehr weit aufgebrochen, total verkeimt.

Es sind zwei alte Dac-Hybriden, die entweder noch von Hiller stammen oder im gleichen Beet aufgelaufene Sämlinge von Hiller-Pflanzen darstellen.

Es ist eine eigentlich sehr schöne gepunktete majalis-"?Hybride?" und eine nicht gepunktete incarnata-Hybride.

Von beiden Klonen wurden jeweils zwei Sprosse oberflächlich sterilisiert.

Ob die Hiller-Pflanzen wirklich Hybriden darstellen, ist bis heute nicht geklärt, sicher ist nur, dass aus rechtlichen Gründen immer Hybride angehängt wurde.

Timm Willem

Zitat von: Uhu am 06.Nov.11 um 10:49 Uhr
Interessante Methode. Simon, welche Erfahrungen konntest Du mit diversen Arten machen. Ist die Methode bei allen Dactys, evt auch bei anderen Knollenorchideen, erfolgreich? Ich denke besonders an kleinwüchsigere Arten von denen es nicht so häufig saatgut gibt.

Wieviele Knollen darf man bei Erfolg erwarten oder bildet sich ein undifferenziertes Meristemgewebe, welches immer weiter vermehrt werden kann. Hast Du ein Bild vom Rad mit den Pamperskartons?
Hallo Jürgen,
es ist nicht so einfach solche generelle Fragen zu beantworten. Zunächst würde ich aus eigener Erfahrung damit, etwa sechs Jahre, behaupten es geht relativ problemlos mit den meisten Dac., mit möglicherweise nur sehr wenigen Ausnahmen.

Warum funktioniert es mit Dac.? Ganz einfach, die Kultur von Sämlingen verlangt keinen so großen Aufwand. Die Grundvoraussetzung ist, die Kulturbedingungen für eine Art bei der Aussaat im Glas relativ gut zu beherrschen, das ist für Dac nicht so problematisch. Es reicht dabei jedoch nicht ein paar Protokorme im Glas zu erzeugen, man sollte Jungpflanzen über Jahre steril kultivieren können.

Daraus kann man dann mit dem Wissen über allgemein angewendete veg. Vermehrungsmethoden eine für Dac. speziell konzipierte Methode ableiten.

So, und jetzt zur bitteren Wahrheit: da ich mich speziell mit Cypris und Dac.(ein wenig noch mit Gymnadenia) beschäftige und die Sämlingskultur bei anderen Arten immer vernachlässigt habe, kann ich auch darüber hinaus kaum etwas zur veg. Vermehrung schreiben.

Ein paar Ausnahmen gibt es:
Bei Epipactis ist es ohne Probleme bei mehreren Arten und Hybriden gelungen Sprosse zu sterilisieren und daraus umfangreiche Kulturen anzulegen. Ausnahme: atrorubens

Ebenfalls sehr einfach über Kallus scheinen Gattungen wie Calypso, Calopogon, Pleione und alle anderen Gattungen mit Pseudobulben zu funktionieren.

Zum Vermehrungspotential über diesen Weg: es ist generell keine eng gefasste technische Begrenzung erkennbar. Das größte Problem ist, dass ich sehr viele solcher Spielereien mache und diese meist nach einer kritischen Anfangsphase ohne weitere Beachtung bleiben. Es kommt dadurch fast nie zu einer wirklich umfangreichen Vermehrung, geschweige denn zu größeren Zahlen pikierfähiger Jungpflanzen zum richtigen Zeitpunkt.

Timm Willem

So noch der aktuelle Stand: von beiden Klonen ist zunächst leider nur Spross steril geblieben, der jeweils andere wir noch einmal gebleicht.

Die sterilen Sprosse zeigen, wie zu erwarten, bereits erhebliche Streckung, man muss sehen, ob da nicht irgendwo doch noch Keime drin sind.

Es waren von beiden Klonen eigentlich ausreichend Pflanzen vorhanden, es hätte also für eine sinnvolle Fallzahl auch gereicht. Als ich aber gesehen habe in welchem Zustand sie bereits sind und wie gering die Erfolgsaussichten nach meiner Einschätzung sein mochten, wollte ich nicht mehr so viele Pflanzen opfern.

winwen

"es gibt zwei mögliche Wege nach der Oberflächensterilisation weiter zu verfahren. Eine einfache Vermehrung über entwickelnde axillare Sprossmeristeme oder durch eine mehrstufige Kallusphase(omnipotenes Zellgewebe)."

Hallo Tim,
für einfache Gemüter wie mich: die 2. Methode inkludiert
1.) zunächst die Bildung von Callusgewebe anzuregen
2.) das Callusgewebe zu teilen und zu vermehren und
3.) das Callusgewebe wieder zu ausdifferenzieren zu bewegen (wahrscheinlich schwierig)

die 1. Methode (die gewählt wurde) ist mir nicht klar. Callusproduktion ist da offenbar nicht das Ziel. Heißt das, dass der Ursprungssproß hier dazu angeregt werden soll ständig neue Tochterknollen zu bilden? Geht das denn unbegrenzt oder erschöpft sich die Reproduktionsfähigkeit des "Ursprosses" irgendwann?
Müssen da die Tochterknollen nicht rechtzeitig separiert und getrennt weiterkultiviert werden? Klingt nach ziemlich viel Sterilarbeit!

Vor allem aber: Lohnt diese Arbeit überhaupt - ich meine: ist da gegenüber der sonst gepflogenen frühzeitigen Tochterknollenabnahme ein echter Vorteil drin?

Berthold

Zitat von: winwen am 14.Nov.11 um 12:47 Uhr
Vor allem aber: Lohnt diese Arbeit überhaupt - ich meine: ist da gegenüber der sonst gepflogenen frühzeitigen Tochterknollenabnahme ein echter Vorteil drin?


Erwin, es geht hier um grundlegende Versuche.

Wenn man auf die Schnelle 20000 Pflanzen eines besonders schönen Individuums braucht, ist das Knollenteilen zu mühsam.
Weniger gelobt ist genug kritisiert (frei nach Peter Altmaier)

winwen

Zitat von: Berthold am 14.Nov.11 um 13:13 Uhr
Erwin, es geht hier um grundlegende Versuche.

Wenn man auf die Schnelle 20000 Pflanzen eines besonders schönen Individuums braucht, ist das Knollenteilen zu mühsam.
Aha! Und im Glas ist es einfacher?
Ich gehe davon aus, dass auch dort die neuen Knollen separiert werden müssen. Wie sollte sonst noch mehr nachkommen?

Prinzipiell gefragt:
Stimmt meine Annahme über die 2. Methode (im Prinzip nichts anderes als sterile frühe Knollenabnahme, wobei das Medium so gestaltet ist, dass es die immer weitere Knollenbildung speziell anregt)?
Und wenn ja, um wieviel produktiver ist das gegenüber der Standardvariante? Will sagen: zahlt sich der Aufwand überhaupt aus? (20000 Exemplare auf einmal sind nicht gut für den Marktwert!)

Timm Willem

Zitat von: winwen am 14.Nov.11 um 12:47 Uhr
"es gibt zwei mögliche Wege nach der Oberflächensterilisation weiter zu verfahren. Eine einfache Vermehrung über entwickelnde axillare Sprossmeristeme oder durch eine mehrstufige Kallusphase(omnipotenes Zellgewebe)."

Hallo Tim,
für einfache Gemüter wie mich: die 2. Methode inkludiert
1.) zunächst die Bildung von Callusgewebe anzuregen
Leider ist das bei Dactylorhiza sehr stark vom Genotyp abhängig, es passiert meist spontan oder gar nicht, aber durch gezielte und vor allem kontrollierte Anregung nur bei einem kleineren Teil.
Zitat von: winwen am 14.Nov.11 um 12:47 Uhr
2.) das Callusgewebe zu teilen und zu vermehren und
3.) das Callusgewebe wieder zu ausdifferenzieren zu bewegen (wahrscheinlich schwierig)
Das Kallusgewebe differenziert ohne Hormone entweder spontan zu Sprossen aus, oder gar nicht, das kann bei Dac. leider auch passieren.
Zitat von: winwen am 14.Nov.11 um 12:47 Uhr
die 1. Methode (die gewählt wurde) ist mir nicht klar. Callusproduktion ist da offenbar nicht das Ziel. Heißt das, dass der Ursprungssproß hier dazu angeregt werden soll ständig neue Tochterknollen zu bilden? Geht das denn unbegrenzt oder erschöpft sich die Reproduktionsfähigkeit des "Ursprosses" irgendwann?
Es geht darum, dass die normalen Reservemeristeme zur Vermehrung genutzt werden, in diesem Fall bilden sich zunächst keine Knollen, es werden lediglich die Sprosse vermehrt. Bei dieser Methode besteht eigentlich nicht die Gefahr, dass sich die "Reproduktionsfähigkeit" in absehbarer Zeit erschöpft, bei Phalaenopsis wurden teilweise aus einem Auge mehrere Millionen Jungpflanzen vermehrt, bis es dann aber doch zur somaklonalen Variation kam und damit zu einem wertlosen Gemisch.

Bei der Vermehrung über eine Kallusphase ist die Gefahr von Zellentartung sehr viel größer, dies führt meist dazu, dass die Regenerationsfähigkeit immer weiter zurück geht. Die Mutter meiner Kinder hat da, glaube ich, mal etwas zu veröffentlicht, da wurde durch Kryokonservierung ein bestimmter Zelltyp aus degenerierenden Kallusmischstrukturen heraus selektiert, das waren dann die gesunden, dem Ursprung entsprechenden Zellen.
Zitat von: winwen am 14.Nov.11 um 12:47 Uhr
Müssen da die Tochterknollen nicht rechtzeitig separiert und getrennt weiterkultiviert werden? Klingt nach ziemlich viel Sterilarbeit!
Ich denke, das ist lösbar, es muss eine technische Lösung gefunden werden. Ich mach das ja um eventuell einen allgemein funktionierenden Weg zu finden, bei dem ich genau kontrollieren kann wie Qualität und Vermehrung sich optimal zueinander verhalten.
Zitat von: winwen am 14.Nov.11 um 12:47 Uhr
Vor allem aber: Lohnt diese Arbeit überhaupt - ich meine: ist da gegenüber der sonst gepflogenen frühzeitigen Tochterknollenabnahme ein echter Vorteil drin?
Ich hatte mal sterilisierte Hybridklone, da war die potentielle Vermehrungsrate nicht mehr abschätzbar, da aus praktisch jeder Zelle ein PLB entstand und auf jedem PLB wieder sehr viele neue PLBs entstanden. Es gibt aber auch bei Dac Klone mit sehr geringer Vermehrungsrate, die kann man aber ja rund ums Jahr weiter vermehren.

Timm Willem

Zitat von: winwen am 14.Nov.11 um 15:55 Uhr
Aha! Und im Glas ist es einfacher?
Ja, weil viel schneller.
Zitat von: winwen am 14.Nov.11 um 15:55 Uhr
Ich gehe davon aus, dass auch dort die neuen Knollen separiert werden müssen. Wie sollte sonst noch mehr nachkommen?
Nein, man braucht zunächst keine Knolle, eigentlich sind sie auch nur lustige Anhängsel am Spross. Der Spross kann eigentlich ausreichend Stoffe speichern, es muss bei den Pflanzen ja nicht für einen ganzen Winter reichen.
Zitat von: winwen am 14.Nov.11 um 15:55 Uhr
Prinzipiell gefragt:
Stimmt meine Annahme über die 2. Methode (im Prinzip nichts anderes als sterile frühe Knollenabnahme, wobei das Medium so gestaltet ist, dass es die immer weitere Knollenbildung speziell anregt)?
Der Gedanke ist schon richtig, es geht aber nicht um die Knollen, sondern nur um die Sprosse.
Zitat von: winwen am 14.Nov.11 um 15:55 Uhr
Und wenn ja, um wieviel produktiver ist das gegenüber der Standardvariante? Will sagen: zahlt sich der Aufwand überhaupt aus? (20000 Exemplare auf einmal sind nicht gut für den Marktwert!)
Es ist sehr viel produktiver, aber um wie viel kann man nicht genau sagen, das ist bei Dac zu stark vom Klon abhängig.

Ich kann hier leider keine alten Bilder zeigen, aber Claus hat vielleicht Fotos von Gläsern mit unkontrollierter Vermehrung bei Dac.(habe ich auch aber nicht im Wohnhaus)

Der Marktwert interessiert mich bei solchen Versuchen nur sehr wenig. Man muss halt schon drauf achten, dass man nicht in übermäßiger Begeisterung etwas anfängt, was man nie zu Ende bringen kann. Den Fehler habe ich bei Cypris schon zu oft gemacht.

Timm Willem

#27
Es ist wieder etwas geschehen.

Ich möchte hier mal einen Ausfallbericht einfügen, da es bei den Ausfällen eine interessante Variante gibt!

Es waren ja insgesamt nur vier Explantate geschnitten worden, da sich sehr schnell herausstellte, dass die Dac.-Sprosse eigentlich, da sie schon viel zu weit entwickelt waren dafür überhaupt nicht mehr geeignet waren.

Zunächst mal die gute Nachricht, es ist von den zwei Hybridklonen jeweils ein Explantat bis jetzt steril geblieben, diese beginnen zu wachsen und wurden weiter zerschnitten, um auch zu prüfen, ob keine Kontamination im Explantat schlummern. Sieht bis jetzt gut aus.

(Einer der Klone scheint sich jedoch auf lange Sicht gesehen gegen die Sterilkultur mit starker Phenolbildung etwas zu sträuben.)

Der eigentliche Anlass dieses Berichts sind die beiden ausgefallenen Explantate.

Auf dem ersten Foto ist vermutlich lediglich eine etwas schlampige Arbeitsweise dokumentiert, nichts Genaues weiss man nicht.

Auf dem zweiten Foto sind diverse Kontaminationen durch Bakterien zu sehen, interessant ist dabei die Tatsache, dass es nicht nur eine ist, auch die Entfernung zum eigentlichen Explantat, ist ein Indiz. Es deutet an, dass sich da etwas verselbstständigt hat, nämlich Grasmilben. Tatsächlich sind Milben mittlerweile an der Glaswand sichtbar.

Wie können Milben oder deren Eier eine Oberflächensterilisation überleben, ganz einfach, sie sitzen nicht an der Oberfläche. Sie sind durch die bereits geöffneten Hüllblätter bis weit ins Innere eingedrungen, Wahrscheinlich um Eier für die Wintermonate abzulegen. Lustig ist dabei, dass die Milben sich, wenn sie sich erst mal im Glas vermehrt haben, gezielt von einem Glas zum nächsten bewegen und dort meist Pilzsporen eintragen. Da ich immer wieder diese Probleme nach der Etablierung von Hemerocallis hatte, kann ich nur davor warnen jemals etwas mit Hemerocallis zu versuchen, und jetzt auch nicht mehr mit Dactylorhiza.

Bei wohl deutlich mehr als 1000 Gläsern kann man sich nach einer solchen Erstkontamination ein paar schöne Abende damit machen, alle Gläser zwei bis drei Monate lang fortlaufend auf diese so genannten Sekundärkontaminationen zu untersuchen.

In diesem Fall habe ich aber wohl noch mal großes Glück gehabt, das entsprechende Glas habe ich sehr früh aussortiert, es stand nur noch zur Entsorgung, fest zugeschraubt im HWR.

Der Fortschrittsbericht zu den steril gebliebenen Explantaten folgt erst etwas später, da das wachsende Gewebe durch die dicken Glaswände noch nicht Fotografiert werden kann.

Claus

Ähnliche Beobachtungen kann man bei Grünaussaaten aus ungeöffneten Kapseln machen. Die Kapseln, die äußerlich unversehrt aussehen, können im Innern ein reges Leben haben. Ein Insekt hat die Kapselwand angestochen, dort Eier hineingelegt, und wenn man dann die außen mit DanKlorix desinfizierten Kapseln öffnet, krabbeln einem Maden entgegen. So auch wieder im Frühjahr geschehen bei grünen Kapseln von Anacamptis pyramidalis.
Wer Chemiker werden will, muss Chemie studieren; wer Jurist oder Arzt werden will, muss Jura oder Medizin studieren. Aber um Politiker zu werden, ist lediglich das Studium der eigenen Interessen notwendig. (Max O'Rell)

Timm Willem

Hallo Claus,
das mit den Maden aus Cypri-Kapseln habe ich auch schon gehabt. Öfter hatte ich auch an Cypris Blattläuse, es sieht alles gut aus, aber durch das Zerschneiden der Kapsel verteilt man die im Gewebe sitzende Kontamination.

Die Milben haben aber eine andere Qualität, da sie sich selbstständig und gezielt von Glas zu Glas bewegen und wohl bei der kommerziellen Vermehrung einen sehr großen Schaden anrichten.